Articolo metodologico

Trabecolare Risposta Meshwork a pressione Elevation nel Living Human Eye

DOI:

10.3791/52611

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20 giugno 2015

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1Department of Ophthalmology, UPMC Eye Center, Eye and Ear Institute, Ophthalmology and Visual Science Research Center, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh, 3The McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Deptartment of Biostatistics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trabecolare (TM) di migrazione nello spazio canale di Schlemm può essere indotta da aumento della pressione acuta per ophthalmodynamometer, e osservato per dominio spettrale Tomografia a coerenza ottica. L'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare la risposta morfometrica del tratto di efflusso all'elevazione pressione acuta vivono in tessuti viventi in situ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le caratteristiche meccaniche del trabecolato (TM) sono legate alla resistenza al deflusso e la pressione intraoculare (IOP) regolamento. La logica dietro questa tecnica è l'osservazione diretta della risposta meccanica del TM all'elevazione IOP acuta. Prima della scansione, IOP è misurata al basale e durante l'elevazione della PIO. Il limbus è scandita da spettrale-dominio tomografia a coerenza ottica al basale e durante l'elevazione della PIO (ophthalmodynamometer (ODM) applicata a 30 g forza). Le scansioni sono trattati per migliorare la visualizzazione del percorso acquosa umorismo deflusso utilizzando ImageJ. Punti di riferimento vascolari sono utilizzati per identificare corrispondenti sedi in basale e IOP volumi di scansione di elevazione. Schlemm canale (SC) sezione trasversale (SC-CSA) e la lunghezza SC da anteriore a posteriore lungo il suo asse sono misurati a mano a 10 posizioni all'interno di un segmento 1 mm SC. Medio interno della distanza parete esterna (lunghezza dell'asse corto) è calcolato come la zona di SC diviso per la sualunghezza lungo l'asse. Per esaminare il contributo dei tessuti adiacenti l'effetto IOP elevazioni, le misurazioni si ripetono senza e con il rilassamento della muscolatura liscia con instillazione di tropicamide. Migrazione TM in SC si oppone TM rigidità, ma viene esaltata dal sostegno dei suoi attacchi al muscolatura liscia adiacente all'interno del corpo ciliare. Questa tecnica è il primo a misurare la risposta umana vivente TM all'elevazione pressione in situ in condizioni fisiologiche all'interno dell'occhio umano.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glaucoma è la seconda principale causa al mondo di cecità irreversibile 1. Pressione intraoculare (IOP) è un importante fattore di rischio causale per la presenza e la progressione del glaucoma 2-7.   IOP è regolata dalla equilibrio tra la formazione e il deflusso dell'umore acqueo 8. Le posizioni di maggiore resistenza al deflusso sono il tessuto juxtacanicular e la parete interna del canale Schlemm (SC), l'interfaccia tra SC e trabecolato (TM) 9-11. Mentre TM rigidità può contribuire alla prevenzione di SC crollo di fronte alla elevazione IOP, Overby et al. 12 ha recentemente dimostrato che l'espressione genica nel glaucoma è alterato, con conseguente aumento di irrigidimento SC endoteliali, impedendo la formazione di pori, con conseguente elevazione IOP in occhi glaucomatosi 13. TM morfologia e la rigidità in correlazione con facilità di deflusso 14,15, sottolineando tha bisogno di misurare le caratteristiche biomeccaniche.

Atomic misurazioni forza di microscopia della TM mostrano elevata rigidità occhi donati da pazienti affetti da glaucoma (81 kPa) rispetto con gli occhi da donatori senza glaucoma (4,0 kPa) 16, ma queste misure sono state effettuate in ex vivo tessuti sezionati. Il TM posteriore è ancorata nel muscolo ciliare via tendini anteriori delle cellule muscolari longitudinali che si inseriscono in esterno lamellare e cribiform TM 17. Ciliare muscolo (CM) può incrementare TM tautness, imitando elevata rigidità TM 17. La capacità di osservare alterazioni nella resistenza a SC crollo indotto da perturbazioni di muscolatura liscia è stato dimostrato in un modello animale 18. Abbiamo dimostrato la capacità di immagine in modo non invasivo il sistema primario umorismo deflusso acquosa a vivere occhi umani distale ad includere SC utilizzando spettrale dominio tomografia a coerenza ottica (OCT) 19-21. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato la capacità di quantificare la risposta morfometrica della TM e SC di IOP acuta elevazione 22.

L'obiettivo generale del metodo qui descritto è stato quello di quantificare la risposta morfometrica del tratto di efflusso di elevazione IOP acuta che vive nei tessuti viventi in situ. Questa tecnica ha il vantaggio di esaminare l'TM in condizioni fisiologiche, che comprende i contributi sia dell'attività fibre contrattili all'interno TM e CM a TM rigidità, rispetto alle misurazioni effettuate pubblicati in tessuti sezionati. La logica alla base di applicare questa tecnica per l'osservazione della risposta meccanica TM è che ci fornisce altrimenti non disponibili approfondimenti sul comportamento meccanico del TM, che ora sappiamo essere collegato direttamente alla resistenza deflusso e la regolamentazione IOP 13. Discernere il contributo dei tessuti contrattili di rigidità complessiva, un piccolo cohort di soggetti è stato esaminato senza e con soppressione dell'attività muscolatura liscia con la somministrazione di tropicamide.

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: approvazione è stata ottenuta dalla Institutional Review Board della University of Pittsburgh School of Medicine, prima soggetto reclutamento iniziato. Tutti i soggetti hanno fornito consenso informato scritto prima della partecipazione allo studio.

1. Acquisizione Dati

  1. Pressione Elevation
    1. Prendere le misure di base (IOP e ottobre misurazioni) instillando una goccia di 0,5% proparacaina nell'occhio. Attendere 3 minuti per l'efficacia.
    2. Esercitare una leggera pressione alla sclera temporale con l'ophthalmodynamometer, 30 g di coorte 1, e 5 e poi 10 g di coorte 2. Quindi prendere le (IOP e ottobre) misure desiderate come segue
      1. Misure IOP
        1. Misurare IOP basale. Elevare pressione come descritto nella sezione 1.1.
        2. In coorte 1 instillare una goccia di 0,5% proparacaina, consentire 3 min per l'efficacia, e applicare 30 g di pressione alla sclera. Mentre viene applicata la pressione, la misura IOP utilizzando il tonometro seguente manufale istruzioni del cturer.
        3. In coorte 2, infondere una goccia di 0,5% proparacaina, consentire 3 minuti per l'efficacia e applicare 5 g di pressione sclerale con un ophthalmodynamometer. Misurare IOP durante l'elevazione della pressione utilizzando le istruzioni tonometro seguente costruttore.
          1. Attendere 5 minuti dopo la misura 5 g.
          2. Applicare 10 g di pressione sclerale per ophthalmodynamometer, e misurare IOP durante l'elevazione della pressione utilizzando il tonometro seguendo le istruzioni del produttore. Registrare la IOP e condizione (ad esempio, di base o 10 g) nel record di studio.
      2. Ottobre Scansione
        1. Sedile il soggetto sullo scanner ottobre. Inserisci i dati anagrafici del paziente per nuovi soggetti, o richiamare i dati demografici dal database ottobre per i soggetti già sottoposti a scansione.
        2. Selezionare il protocollo 512 x 128 scansione del segmento anteriore. Centrare l'occhio nella finestra dell'immagine video. Diminuire la distanza tra lo scannere l'occhio fino a quando appare l'immagine della cornea sezione nella finestra di scansione
        3. Utilizzando comandi verbali posizionare limbus temporale al centro della finestra di scansione dirigendo lo sguardo paziente in direzione nasale
        4. Acquisire la scansione di base, e rivedere la scansione per la qualità. SE accettabili, risparmiare, e se non è accettabile, ripetere questo passaggio.
          1. Accetta scansioni se non ci sono lampeggia, e l'angolo è visualizzato in tutto il volume senza deriva fuori del bordo dell'immagine o capovolgere in alto.
        5. Instillare una goccia di 0,5% proparacaina, consentire 3 minuti per l'efficacia, e ripetere i passaggi 1.3.2 tramite 1.3.5.
        6. Per coorte 1, applicare 30 g di pressione sclerale per ophthalmodynamometer, e acquisire la scansione mentre viene applicata la pressione. Togliere la pressione e rivedere la scansione per la qualità. SE accettabili, risparmiare, e se non è accettabile, ripetere questo passaggio.
        7. Per coorte 2, applicare 5 g di pressione sclerale per ophthalmodynamometer, e acquisire la scansione mentre viene applicata la pressione. Togliere la pressione e rivedere la scansione per la qualità. SE accettabili, risparmiare, e se non è accettabile, ripetere questo passaggio.
        8. Attendere 5 min consentendo all'occhio di riprendersi dalla 5 g perturbazione pressione.
        9. Per coorte 2, applicare 10 g di pressione sclerale per ophthalmodynamometer, e acquisire la scansione mentre viene applicata la pressione. Togliere la pressione e rivedere la scansione per la qualità. SE accettabili, risparmiare, e se non è accettabile, ripetere questo passaggio.
        10. Registrare il tempo di scansione, condizione (ad esempio, di base o 10 g) e la posizione nel record di studio.

2. Elaborazione Dati

  1. Collegare un dispositivo di archiviazione USB ad alta capacità in ottobre Selezionate "Esporta" dal menu Record in ottobre Designare un percorso di file per file esportati sull'unità USB. De-selezionare l'opzione ".zip". Immettere il nome del paziente per scans da esportare, e selezionare le scansioni da esportare. Avviando l'esportazione.
  2. Una volta completato l'esportazione, smontare il drive USB e togliere dal Ottobre Collegare il drive USB ad alta capacità contenente le immagini esportate nella workstation di elaborazione delle immagini.
  3. Avviare il programma di elaborazione delle immagini in questo caso ImageJ.
  4. Importare i dati di immagine raw; selezionare "File -> Import -> Raw" dal menu File. Selezionare il file con desinenza in "_cube_raw.img" da elaborare dal drive USB.
  5. Salvare il file importato utilizzando un nuovo nome, in modo che i dati dell'immagine originale viene salvato inalterato (http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages).
  6. Immettere i parametri di importazione come segue, Tipo di immagine: 8 bit, Larghezza: 512, Altezza: 1.024, Offset: 0; Numero di immagini: 128.
  7. Selezionare "Plugins -> R EGISTRAZIONE -> StackReg" dal menu plugin. E quindi selezionare l'opzione "corpo rigido"Opzione. Quindi selezionare "File -> Salva con nome -> TIFF" per salvare lo stack allineati.
  8. Selezionare "Processo -> Filtri -> media 3D" dal menu di processo. Immettere i parametri X = 1, Y = 1, e Z = 1 come le opzioni di filtro. Ripetere questa operazione due volte.
  9. Selezionare "File -> Salva con nome -> TIFF" per salvare la pila media. Gira la ruota del mouse per passare al fotogramma 1 della pila attiva.
  10. Selezionare "Processo -> Migliora contrasto locale (CLAHE)" dal menu Processing. Utilizzare la dimensione del blocco parametri: 31, bidoni istogramma: 256, pendenza massima: 5, Maschera: nessuno, e selezionare l'opzione "fast". Utilizzare il tasto freccia destra per passare al fotogramma successivo.
  11. Sposta telaio 2 della pila attiva e ripetere il Process-> Migliora contrasto locale (CLAHE). Ripetere l'operazione fino a quando tutti i fotogrammi hanno avuto un contrasto migliori.
  12. Selezionare "File -> Salva con nome -> TIFF"; per salvare lo stack con mdc. Quindi selezionare "Immagine -> Regola -> Taglia" dal menu Immagine. Deselezionare l'opzione "Vincola Proporzioni", quindi inserire Larghezza: 2.048 e altezza: 1.024 valori.
  13. Selezionare "Immagine -> Trasforma -> Rifletti verticalmente" dal menu Immagine. Quindi selezionare "Analizza -> Imposta Scala" dal menu Analizza. Inserisci la distanza in pixel: 2.048, distanza nota: 4.000, e Pixel Aspect Ratio: 1, e fare clic su OK. Selezionare "File -> Salva con nome -> TIFF" per salvare la taratura 1: 1 rapporto di aspetto dello stack.
  14. Lentamente girare la ruota del mouse per esaminare visivamente le scansioni per identificare un incrocio nave distintivo per servire come un punto di riferimento all'interno scansioni. Registrare il numero di immagini e di riferimento numero di fotogramma nel foglio di calcolo di analisi.
  15. Premere la freccia sinistra tasto 15 volte per andare al primo fotogramma di misura. Selezionare l'opzione "SelectionsR Freehand21; strumento dalla barra degli strumenti.
  16. Posizionare il mouse al centro di SC e premere la freccia in su. Ripetere questa operazione fino a quando SC riempie lo schermo.
  17. Manualmente segmento SC cerchiando il confine con il mouse. Tenere premuto il tasto di controllo (Ctrl) e premere D per la cornice dell'immagine corrente. Tenere premuto il tasto Ctrl e premere M. Trascrivere la misura della SC sezione trasversale e il numero di telaio di misura per il foglio di calcolo di analisi. De-selezionare l'area delineata. Premere il tasto 3 volte freccia a destra. Ripetere questa operazione fino a quando SC è stata misurata in 10 fotogrammi.
  18. Premere la freccia sinistra tasto 30 volte per tornare al primo fotogramma di misura.
  19. Selezionate lo strumento segmento direttamente dalla barra degli strumenti.
  20. Tracciare una linea retta dalle anteriore-più a posteriori più a posizioni SC. Tenere premuto il tasto di controllo e premere D solo per il frame corrente. Tenere premuto il tasto di controllo e premere lunghezza M. Trascrivere SC e il numero di telaio per il foglio di calcolo di analisi. De-selezionare l'area delineata. Premere il tasto freccia destra3 volte. Ripetere questa operazione fino a quando la lunghezza SC è stato misurato negli stessi 10 fotogrammi come l'SC area della sezione trasversale.
  21. Inserire l'equazione SC-IOWD lunghezza = SC-CSA / assiale nel foglio di calcolo di analisi per il calcolo medio SC interno muro di distanza esterna a parete (SC-IOWD) dividendo le misurazioni dell'area dalle misure di lunghezza.
  22. Premere la freccia sinistra tasto 30 volte per tornare al primo fotogramma di misura.
  23. Selezionate lo strumento segmento direttamente dalla barra degli strumenti.
  24. Tracciare una linea retta dal antero-più sul SC fino al confine della rete trabecolare e camera anteriore. Assicurarsi che la linea è perpendicolare al confine. Tenere premuto Ctrl e premere D, poi M.
  25. Tracciare una linea dal posteriore-più luogo di SC e il confine della TM e la camera anteriore. Assicurarsi che la linea perpendicolare al bordo. Hold Control e premere D, poi M.
  26. Tracciare una linea dal centro di SC e il confine della TM e la camera anteriore. Assicurarsi che il line perpendicolare al confine. Tenere premuto il tasto di controllo e premere D solo per il frame corrente.
  27. Trascrivere le tre misure di spessore TM e numero di frame al foglio di calcolo di analisi. Per fare questo, premere il tasto 3 volte freccia a destra. Ripetere questa operazione fino a quando lo spessore TM è stato misurato negli stessi 10 fotogrammi come l'SC area della sezione trasversale.

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Risultati

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Usando queste tecniche di acquisizione dati e di analisi delle immagini, gli effetti di piccole e grandi variazioni di IOP sui parametri morfologici tratto di efflusso come SC sezione trasversale sono ottenuti (Figura 1). Possiamo vedere che alti livelli di aumento IOP producono un crollo osservabile di SC, come rappresentato da una grande riduzione dell'area della sezione trasversale. L'occhio sembra essere in grado di accogliere piccoli aumenti IOP, come dimostra la mancanza di cambiamento in SC-CSA <...

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Discussione

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L'attuale tecnica sfrutta osservazione non invasiva della risposta meccanica del tessuto molle quantificare SC collasso. I lavori futuri con gli occhi cadavere dell'uomo è necessaria per calibrare deviazioni tessuto rigidità tessuto reale dopo la dissezione. Ma, tali studi subiranno gli stessi limiti dei modelli di deflusso precedenti; in particolare, che i contributi del muscolo vivere a tensione dei tessuti non saranno presenti. Ulteriori calibrazione in un modello dell'occhio dei mammiferi vivente può con...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Schuman ricevuto royalties per la proprietà intellettuale in licenza da Massachusetts Institute of Technology e del Massachusetts Eye and Ear Infirmary di Zeiss, Inc.

Ringraziamenti

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Supportato in parte dai contratti R01-EY13178 e P30-EY08098 del National Institute of Health (Bethesda, MD), dalla Eye and Ear Foundation (Pittsburgh, PA) e da sovvenzioni illimitate da Research to Prevent Blindness (New York, NY).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dominio spettrale OCTZeissCirrus
Imaging WorkstationAppleiMac
OftalmodinamometroBaillairt Matalene Oftalmodinamometro, Strumenti chirurgici CO., Inc. Programma
rsb.info.nih.gov/ijImageJ, FIJI
di elaborazione delle immagini di New York, NY

Riferimenti

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