Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Quantitative amplificazione degli acidi nucleici è una tecnica importante per il rilevamento di ambientale, di origine alimentare, e gli agenti patogeni di origine idrica, nonché per la diagnostica clinica. Real time PCR quantitativa (qPCR) è il metodo gold standard per il rilevamento sensibile, specifico e quantitativa degli acidi nucleici, ad esempio, per l'HIV-1 test di carica virale, il rilevamento di batteri patogeni, e lo screening per molti altri organismi 1 – 3. Durante tempo reale qPCR, primer amplificano patogeno DNA in cicli, e un segnale fluorescente viene generato che è proporzionale alla quantità di DNA amplificato nel campione ad ogni ciclo. Un campione contenente una concentrazione sconosciuta di DNA patogeno può essere quantificato utilizzando una curva standard che riguarda la concentrazione di DNA iniziale di campioni standard e il momento in cui il segnale fluorescente raggiunge una certa soglia (cioè, la soglia ciclo o C T).
<p class="Jove_content"> Perché in tempo reale qPCR richiede costose attrezzature cicli termici e diverse ore per ricevere i risultati, tecniche di amplificazione isotermica alternativi, come recombinase polimerasi amplificazione (RPA), sono stati sviluppati 4. Queste piattaforme genere forniscono risultati più rapidi e amplificare acidi nucleici a singolo temperatura inferiore, che può essere realizzato con meno costoso, attrezzature semplici. RPA, che è particolarmente interessante per applicazioni point-of-care, amplifica il DNA in minuti, richiede una temperatura bassa di amplificazione (37 ° C), e rimane attiva in presenza di impurità 5,6. Saggi RPA sono stati sviluppati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l'analisi degli alimenti, degli agenti patogeni, lo screening di farmaci antitumorali, e la rilevazione di agenti biothreat 7-12. Tuttavia, l'uso di RPA per la quantificazione degli acidi nucleici è stata limitata 13,14.In lavori precedenti, è stato shown che in tempo reale RPA quantitativa (qRPA) è fattibile 15. Qui, un protocollo più dettagliata per l'utilizzo in tempo reale quantitativa RPA quantificare campioni sconosciuti utilizzando una curva standard, un metodo che è analogo a quantificazione utilizzando qPCR. Questo protocollo descrive come eseguire una reazione RPA su un termociclatore per rilevare HIV-1 DNA come un proof-of-concept, e come sviluppare un controllo positivo interno (IPC) per garantire che il sistema funzioni correttamente. La raccolta dei dati utilizzando un termociclatore o microscopio e analisi dei dati per la costruzione di una curva standard utilizzando i dati di formazione è anche dettagliato. Infine, il metodo per quantificare i campioni sconosciuti utilizzando la curva standard con uno script personalizzato è dimostrata. Questa tecnica consente qRPA quantificazione dei campioni con concentrazioni sconosciute e ha molti vantaggi rispetto tradizionale in tempo reale qPCR.
1. Programmare l'apparecchio per PCR in tempo reale Reazioni qRPA
2. Preparare per gli esperimenti di HIV-1 qRPA
3. Montare un HIV-1 qRPA Curva Standard
4. Sviluppare un controllo positivo interno
5. Costruire una curva standard da più esperimenti
6. Assay Validazione e quantificazione dei campioni sconosciuti Utilizzola curva standard
7. Preparazione per la raccolta dati utilizzando un microscopio a fluorescenza e un chip riscaldata
8. Data Collection e Analysis Utilizzando un microscopio a fluorescenza
Al fine di ottenere dati di quantificazione significativi utilizzando l'algoritmo di MATLAB, l'utente deve selezionare i valori di input appropriati quando richiesto. Dopo l'avvio ogni script ai punti 5 e 6, tutte le variabili di input sono sollecitati automaticamente nella finestra di comando e le uscite sono generati automaticamente. Nella Sezione 5.7 all'utente viene richiesto di selezionare una soglia pista. Il valore della soglia pista colpisce il quadrato del coefficiente di correlazione (r 2) della forma. Quando si utilizzano i dati di fluorescenza prime esportate da un termociclatore, valori compresi tra 2.0 e 5.0 tendono a produrre un elevato coefficiente r 2. Nella Sezione 5.8 l'utente deve indicare il numero di deviazioni standard sopra lo sfondo per impostare la soglia positiva. Per segnare un campione come positivo o negativo, lo script determina automaticamente il campione differenza Δ tra la fluorescenza massima e minima per ogni campione utilizzando i dati di fluorescenza prime esportate dal thermal cycler. Calcola la differenza media di sfondo Δ e deviazione standard σ sfondo per i campioni di controllo tutti i no-target. Un campione viene considerato positivo se il campione Δ è più di z × sfondo σ sopra Δ sfondo. Nella Sezione 5.10 l'utente decide se utilizzare la soglia predefinita o impostare una nuova soglia. Se l'utente desidera impostare una nuova soglia, determinare la nuova soglia sperimentalmente effettuando 3 esperimenti contenenti ciascuna 12 reazioni RPA senza HIV-1 DNA presente. Impostare la soglia per l'aumento medio di intensità di fluorescenza da questi esperimenti più 3 deviazioni standard. Dopo aver completato la sezione 6, lo script JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m ritorna automaticamente la concentrazione di DNA stimato per ogni reazione qRPA (in log10 copie). Se lo script determina che nessun HIV-1 DNA era presente nel campione, la concentrazione stimata viene elencato come "Nequirente per HIV "o" non valido ", a seconda che il segnale fluorescente per il controllo interno positivo superato la soglia (z × σ sfondo + Δ background). Se l'utente sta convalidando la curva standard con concentrazione del campione noti, lo script sarà anche restituire una tabella aggiuntiva simile a quella della tabella 1.
Per sviluppare un saggio RPA tempo reale che fornisce quantificazione accurata, coerenza sperimentale è cruciale. Ad esempio, utilizzare gli stessi primer e della sonda aliquote sia per la curva standard e gli esperimenti di convalida. Anche evitare cicli di gelo-disgelo memorizzando i primer e della sonda aliquote a 4 ° C tra esperimenti anziché -20 ° C. Le aliquote modello utilizzato per gli esperimenti con curva e validazione standard sono memorizzati nello stesso modo. RPA pellets enzimi e reagenti dello stesso lotto vengono utilizzati in conformità alle indicazioni del produttore. Infine, becautilizzare RPA manca "cicli" veri per controllare con precisione la velocità di amplificazione, la standardizzazione dei passaggi degli utenti è assolutamente indispensabile. Durante il montaggio reazioni, l'utente deve seguire sempre gli stessi passi nello stesso ordine, spendendo circa la stessa quantità di tempo ad ogni passo. Reazioni devono sempre essere mescolati delicatamente con un nuovo puntale, e le bolle devono sempre essere eliminati. Prima di amplificazione, le reazioni devono essere tenuti ad una temperatura costante, e il termociclatore o software microscopio devono sempre essere preparati prima di caricare le reazioni per evitare l'amplificazione a temperature sub-ottimali che potrebbero influenzare la quantificazione. Qualsiasi variazione delle condizioni di reazione iniziali può portare a incoerenza risultati sperimentali.
Quando si usa un microscopio per raccogliere dati, variabili aggiuntive devono essere controllati per minimizzare la variazione di intensità di fluorescenza. Tutte le reazioni devono essere collocati nella stessa regione sulla fase più calda, e la microscope deve essere focalizzata sulla stessa regione del pozzo per ogni campione. Anche se queste pratiche sono seguite, i dati di fluorescenza raccolti su un microscopio possono presentare variabilità dovuta ai punti locali luminosi che si formano naturalmente durante le reazioni RPA, la formazione di bolle all'interno delle camere di reazione, o photobleaching derivanti dall'esposizione ripetuta alla luce di eccitazione. L'influenza di queste variabili è evidente nei dati di fluorescenza raccolti sul microscopio (Figure 4A e 4B), che dimostrano la variabilità basale, picchi e depressioni. Queste caratteristiche sono assenti dai dati raccolti fluorescenza sul termociclatore (Figure 3A e 3B). In ultima analisi, la raccolta dei dati sul microscopio ha scopi puramente prova di principio e il test finale sarà implementato su un lettore a fluorescenza campo-operabile con geometrie più precise e software di controllo che riduce al minimo le variabili.
Un'altra importanteaspetto del processo di sviluppo del test qRPA è la coerenza nel trattamento dei dati. Il protocollo descritto nella sezione Metodi utilizza script per elaborare i dati grezzi di fluorescenza (memorizzati in un file di foglio di calcolo) raccolti da un termociclatore o microscopio. Tutti gli esperimenti utilizzati per costruire la curva standard devono essere formattati in modo identico. Quando si utilizza un termociclatore per raccogliere i dati, lo stesso layout di piastra deve essere utilizzato, e dati provenienti da pozzi che non contengono reazioni RPA non deve essere esportato. Quando si usa un microscopio per raccogliere dati, il formato dei dati deve corrispondere al formato dei dati esportati automaticamente dal termociclatore. Ad esempio, i dati non-target-comando devono essere nelle celle C2: C61, e dati per concentrazioni crescenti modello devono essere in celle D2: D61, E2: E61, ecc Se esistono più repliche di ogni concentrazione di un esperimento, la serie 2 ° replicare diluizione deve essere ordinato da sinistra a destra da nessun controllo di destinazione (NTC) a più alta concentrazione esalvato nelle colonne immediatamente a destra del 1 ° replicano serie di diluizioni. Ad esempio, nel layout piastra utilizzata nella sezione 1.2 con 2 repliche per ogni campione, dati di fluorescenza per la 1a copia di ogni campione nella serie di diluizioni devono essere salvati in celle C2: dati H61 e fluorescenza per il 2 ° copia di ogni campione in la serie di diluizione deve essere salvato in celle I2: N61. Per il layout di piastra utilizzata al punto 1.2, questo è il formattazione durante l'esportazione dei dati dal software termociclatore ad un foglio di calcolo di default.
I dati rappresentativi forniti da esperimenti HIV-1 qRPA dimostrano supporto prova di concetto che RPA può essere utilizzato per la quantificazione di concentrazione di acido nucleico in campioni sconosciuti. Clinicamente utili HIV-1 prove di carico virale hanno una gamma clinica di almeno 4 ordini di grandezza, una precisione di 0,5 log10 copie, e un limite di rilevazione-di-di almeno 200 copie 19,20. L'HIV-1 test DNA descritto incontra questi criteria ed è più accurata a basse concentrazioni, come mostrato nella Tabella 1. Pertanto, con l'inclusione di un passo trascrittasi inversa, questi risultati suggeriscono che un test HIV-1 RT-RPA può avere il potenziale per misurare HIV-1 carica virale in campioni clinici. Quando si sviluppa un saggio qRPA, regolando i parametri dell'algoritmo può sintonizzare la gamma dinamica sensibilità e lineare a seconda delle esigenze cliniche. Figura 6 mostra che regolando z (un parametro che determina la soglia per campioni positivi) possono influenzare la sensibilità e la precisione a bassa ed alta concentrazioni target. Inoltre, può essere possibile aumentare la risoluzione e precisione di quantificazione incubando reazioni ad una temperatura inferiore o meno usando acetato di magnesio, riducendo così il tasso di amplificazione.
Questa prova di concetto qRPA test può essere utilizzato per quantificare la concentrazione dei campioni contenenti HIV-1 DNA. Il dosaggio qRPA descritto in questo manuscript include istruzioni dettagliate su come assemblare le reazioni CPT in tempo reale, lo sviluppo e lo schermo di un IPC, ed elaborare i dati grezzi di fluorescenza per costruire una curva standard che può essere utilizzato per quantificare i campioni sconosciuti. Con le istruzioni dettagliate incluse, questo protocollo può essere adattato per quantificare la concentrazione di DNA in una vasta gamma di campioni.
The authors have nothing to disclose.
qRPA Assay | |||
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |