LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Sommario

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Lepr^db e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

Abstract

Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica che colpisce 382 milioni di persone nel 2013, e si prevede un aumento di 592 milioni entro il 2035 ^1. Nel corso degli ultimi 2 decenni, il ruolo di una disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 è stato chiaramente stabilito ^2. Progresso della ricerca ha richiesto metodi per l'isolamento di isole pancreatiche. Il protocollo di isolamento delle isole qui presentata condivide molte fasi comuni con protocolli di altri gruppi, con alcune modifiche per migliorare la resa e la qualità delle isole isolate sia dal tipo selvatico e diabetico ^db LEPR (db / db) topi. Un live-cell imaging metodo 2-fotone è quindi presentata che può essere utilizzato per studiare il controllo della secrezione insulinica entro isolotti.

Introduzione

Il ruolo della disfunzione delle cellule beta nella malattia è stato ampiamente riconosciuto ^3,4. Le linee cellulari, come il MIN6 e INS-1 sono strumenti utili per comprendere la biologia del comportamento delle cellule beta. Tuttavia, il controllo fisiologico della secrezione di insulina avviene all'interno delle isole di Langerhans. Questi isolotti contengono migliaia di cellule beta fitte, così come i vasi sanguigni e di altri tipi di cellule endocrine. Questo ambiente all'interno dell'isolotto influenza la secrezione di insulina, ed è probabile che sia importante nel diabete. Pertanto, per comprendere il controllo fisiologico della secrezione di insulina, e la fisiopatologia della malattia, è essenziale studiare isolotti intatti.

Isolamento Islet

Isole umane vive e, in particolare, isolotti umani provenienti da pazienti affetti da diabete di tipo 2 sono difficili da ottenere. Inoltre, isole umane hanno limitate possibilità di manipolazione molecolare sperimentale. I ricercatori hanno quindi impiegato èlascia da animali e modelli animali di diabete di tipo 2. Un tale modello di malattia è il mouse db / db. Si tratta di una mutazione spontanea che i modelli di diabete di tipo 2 con una progressione fenotipo che ricorda molto da vicino la malattia umana ^5,6. Il protocollo presentato qui per l'isolamento delle isole da diabetici db / db topo ha molti punti in comune con gli altri gruppi con alcuni filtri per migliorare la resa, la purificazione e la sopravvivenza delle isole migliorata.

Imaging 2 fotone

Il live-cella 2 fotoni test qui descritta permette ai ricercatori di quantificare il numero e valutare le caratteristiche dei singoli granuli insulina contenente da molte cellule del diabetico ⁷ e wild type isolotti ^8,9.

Protocollo

NOTA: Tutte le presenti esperimenti sono stati eseguiti secondo le locali procedure di etica animale dell'Università di Queensland (approvati dalla University of Queensland, anatomico Biosciences Comitato Etico).

1. Islet Isolamento

1. Preparazione dei reagenti
   1. Miscela di enzimi
      1. Per la digestione pancreatica, utilizzare una miscela di liberase e collagenasi tipo IV. Diluire liberase TL (termolisina basso) 1 flacone di 5 mg con 26 ml di DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
      2. Preparare collagenasi di tipo IV in tampone di Hank ad una concentrazione di 0,5 mg / ml, supplementato con 5 mM HEPES, 0.5mm CaCl _2, 0,1 mg / ml e DNAsi 1mg / ml sieroalbumina bovina.
      3. Mescolare il TL liberase e soluzioni collagenasi in un rapporto di 4: 1 (in volume), cioè, 4 ml liberase TL + 1 ml di collagenasi. Aliquota della miscela di enzimi per 2,5 ml ciascuna e conservare a -20 ° C.
         NOTA: Le ore di incubazione tessuto vary un po 'tra i lotti di enzima (30 sec a differenza di 1 min). Pertanto, un test di gruppo può essere richiesto.
   2. RPMI Isolamento media
      1. Sciogliere una fiala di RPMI 1640 polvere in 1 l di acqua a temperatura ambiente e integrare con 2 g NaHCO _3, 4.02 g HEPES.
      2. Combina i media isolamento RPMI in una grande beuta, mescolare con agitatore magnetico, regolare a pH 7,4 con NaOH, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
   3. RPMI Media Cultura
   4. Utilizzare coltura RPMI con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici (ad esempio, penicillina 100 U / ml, streptomicina 100 mg / ml).
2. Isolamento Islet e Coltura
   1. Sacrificio animale
      1. Sacrificio topi di dislocazione cervicale o di CO ₂ asfissia secondo le procedure di etica dell'istituzione locale. Spruzzare accuratamente il corpo del mouse con il 70% di etanolo.
   2. Perfusione pancreas
      1. USE 2 tagli lunghi lateralmente attraverso la pelle addominale e del peritoneo per fare un lembo a forma di V. Tirare il lembo della pelle fino a scoprire l'intera cavità addominale, messo da parte dell'intestino e mantenere il fegato in posizione da una carta velina ripiegata per rivelare il dotto biliare comune (figure 1 e 2). Mettere l'animale in modo che la testa verso il chirurgo e la coda dal chirurgo.
      2. Applicare un morsetto vascolare nella ampolla sulla parete del duodeno per bloccare gli enzimi iniettati di entrare duodeno (Figura 1).
         NOTA: Questo è un passo importante in quanto determina se gli enzimi iniettati andranno nel dotto pancreatico e profumato il pancreas o reflusso al sito di iniezione (oltre morsetto) o andare nel duodeno (sotto pinza).
      3. Incannulare dotto biliare comune con un ago G 31 nei pressi dello svincolo del dotto epatico comune e dotto cistico (Figura 1) e lasciare spazio per una seconda iniezione se the pancreas non riesce a perfusione la prima volta. Lentamente (sopra ~ 10 sec) iniettare circa 2 ml di miscela di enzimi freddo nel mouse dotto biliare comune.
         NOTA: Il pancreas saranno perfusi rapidamente se la pinza è nella posizione corretta.
      4. Regolare la posizione di blocco se l'ago si trova all'interno del dotto biliare comune, ma non può profumato pancreas (es., Spostare la pinza un po 'lontano dal fegato se oltre bloccato o spostarlo verso il basso un po' per il fegato se sotto bloccato).
         NOTA: L'ago volte va nella capsula circostante piuttosto che il lume del dotto. Un segno utile per verificare se l'ago è all'interno del dotto biliare comune è la dilatazione del condotto d'iniezione. Se il pancreas non riesce a perfusione, un'alternativa è la miscela enzima potrebbe essere iniettato a più siti del pancreas con minore rendimento previsto. La perfusione del sito sinistra del pancreas (lobo splenica) è importante per la massimizzazione della resa isolotto.
      5. Dopo il pancreas è perfused, rimuovere rapidamente il pancreas, metterla in una fiala (~ 20 ml, vetro) e incubare per ~ 19 min in un bagno di 37 ° C Acque.
         NOTA: Il tempo di incubazione può variare un po 'a seconda del ceppo di topo ed età.
      6. Dopo il tempo di incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo ~ 20 ml di terreni di isolamento freddo. Agitare delicatamente il flacone di interrompere il pancreas e versare attraverso un normale colino del tè (diametro dei pori di 1 mm) in una sterile tubo da 50 ml. Rabboccare il tubo con terreni di isolamento e centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off.
      7. Sciogliere di nuovo il pellet in terreni di isolamento e trasferire due provette da 15 ml, quindi si centrifuga a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. Dopo l'aspirazione del surnatante, miscelare i due palline bene con 6 ml di mezzi di separazione cellulare gradiente di densità (Histopaque soluzione 1077) per provetta nel vortex o pipettando su e giù. Poi aggiungere delicatamente ~ 6 ml dei terreni di isolamento al lato del tubo in cimai mezzi di separazione gradiente di densità e centrifugare a 100 xg per 15 min a 4 ° C con freno off.
      8. Raccogliere il surnatante nella parte superiore (terreni di isolamento), media e bassa (densità cellulare gradiente di mezzi di separazione) strato in 3 piatti separati. Handpick isolotti in questi 3 piatti, usando una pipetta sotto un microscopio da dissezione.
         NOTA: Lo strato intermedio contiene la maggior parte degli isolotti. Isolotti sono riconosciuti come strutture compatte di ~ 50 a 500 micron di dimensione (Figura 3). Otteniamo ~ 200 isolotti in topi WT e 300- <100 isolotti nei topi db / db.
   3. Islet Culturing
      1. Per aiutare gli isolotti riprendersi dalla digestione enzimatica, gruppi culturali di 40 isolotti in un 25 centimetri capsula di Petri con 6 ml RPMI terreni di coltura (10mM glucosio) a 37 ° C, 5% / 95% di CO ₂ / O ₂ per 2 giorni prima dal vivo -cell 2-photon imaging. Modificare il terreno di coltura quotidiano.

2. Live Cell 2-Photon Imaging

1. Preparazione dei reagenti
   1. Extracellulare Buffer
      1. Preparare il sodio ricco tampone extracellulare per il test 2-fotone con 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2,5 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 5 NaHCO ₃ e 10 mM HEPES mM.
   2. Extracellulare Dye
      1. Per il saggio 2 fotoni, preparare magazzino SRB 8 mm in tampone extracellulare, aliquota in piccoli tubi e conservare a -20 ° C. Diluire lo stock SRB 1:10 in tampone fresco extracellulare per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,8 mm.
2. fotone Imaging
   1. Innanzitutto, pre-incubare 2 giorni isolotti coltivate in 3 mM glucosio tampone extracellulare per 30 min.
      NOTA BENE: Usiamo isolotti tra 2 e 5 giorni in coltura.
   2. Quindi, inserire un vetrino sulla camera termo-controllo montato sul palco microscopio. Utilizzare del grasso per impedire la fuoriuscita di soluzione.
   3. Coprire la camera con 500 ml di ExtracellBuffer colare contenente 0,8 SRB mm con differenti concentrazioni di glucosio (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mm) di glucosio.
   4. Quindi, posizionare l'isolotto di pre-incubazione nel mezzo della camera e si concentrano a 3-4 strati di cellule nel isolotto dove, nelle isole di roditori, immunocolorazione per l'insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta.
      NOTA: Il SRB illustrerà tutte le membrane delle cellule dell'isolotto rapidamente e l'isolotto è pronto per l'immagine.
   5. Utilizzare un microscopio 2 fotoni con un obiettivo 60X immersione in olio (NA 1.42) e software di imaging (ad es., Scanimage ^11). La Figura 4 illustra una tipica disposizione microscopia. Immagine eventi esocitosi utilizzando SRB come una membrana impermeant marcatore extracellulare fluorescente eccitato da impulsi laser a femtosecondi a 880 nm, con la fluorescenza rilevati a 550-650 nm. Registrare le risposte isolotto alla stimolazione.
   6. Identificare gli eventi esocitosi singoli dall'improvvisa apparizione di una piccola macchia fluorescente (risoluzione 10 pixel /1; m) e confermare con la fase veloce di salita del segnale fluorescente sopra una regione di interesse (~ 0,78 micron ^2).

Risultati

Resa Islet e purificazione

Per un normale topo wild-type, sono attesi circa 200 isolotti. Isolotti sani guardare luminoso, di forma circolare e un bordo liscio. Un lotto di isolamento su digerito di solito ha piccole e sfocate isolotti mentre un partita sotto-digerito ha meno isolette e isolotti di cellule attaccato acinar (Figura 3). Per diabetici db / db topo, la resa isolotto e l'aspetto dipende dalla progressione della malattia con migliori topi glicemico sono più gr...

Discussione

Il fattore più critico nell'isolamento isolotto è la perfusione iniziale del pancreas; un sotto perfuso pancreas risultati in una resa isolotto notevolmente inferiore. Altri fattori influenzano anche la qualità di isolamento, come il tempo di digestione e il livello di agitazione che potrebbe in parte compensare il livello di perfusione. Ad esempio, un pancreas pienamente perfuso dovrà essere incubate a 37 ° C per ~ 18 min 30 sec agitatore, al contrario un sotto digerito pancreas possono richiedere ~ 20 min digestio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Liberase TL 5 mg	Roche-5401020001
Collagenasi tipo IV-1g	Gibco-Life Technologies	17104-019
Histopaque 1077 500 ml	Sigma Aldrich	10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L	Sigma Aldrich	R1383	per preparare terreni di isolamento
RPMI 1640 (1x) 500 ml	Gibco-Life Technologies	21870-076	per preparare terreni coltivati
Penicillina-Streptomicina 100 ml	Gibco-Life Technologies	15140-122	per preparare terreni coltivati
Siero fetale bovino 500 ml	Gibco-Life Technologies	10099-141	per preparare terreni coltivati
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco-Life Technologies	11966-025	per diluire il
programma Metamorph	Molecular Devices, USA		per analizzare le immagini a 2 fotoni