Articolo metodologico

Una procedura Grande laterale Craniotomia per Mesoscale Wide-field Optical Imaging di Brain Activity

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DOI:

10.3791/52642

⸱

7 maggio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, University of Lethbridge

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per creare una grande craniotomia unilaterale sulle regioni temporali e parietali della corteccia cerebrale del mouse. Ciò è particolarmente utile per l'imaging in tempo reale su un'area espansiva di un emisfero corticale.

Abstract

La craniotomia è una procedura comunemente eseguita per esporre il cervello per gli esperimenti in vivo. Nella ricerca del mouse, la maggior parte dei laboratori utilizzano una piccola craniotomia, in genere da 3 mm x 3 mm. Questo protocollo introduce un metodo per creare una finestra del cranio sostanzialmente quella da 7 x 6 mm esponendo più di un emisfero cerebrale sopra il mouse corteccia temporale e parietale (ad esempio, bregma di 2,5 - 4,5 mm laterale sul 0 - 6 mm). Per eseguire questo intervento, la testa deve essere inclinata di circa 30 ° e gran parte del muscolo temporale deve essere ritirato. A causa della grande quantità di rimozione ossea, questa procedura è previsto solo per gli esperimenti acuti con l'animale anestetizzato durante l'intervento chirurgico e sperimentare.

Il vantaggio principale di questo innovativo grande finestra cranica laterale è di fornire accesso simultaneo a entrambe le zone mediale e laterale della corteccia. Questo grande finestra del cranio unilaterale può essere utilizzato per studiare le dinamiche neurali tra le cellule,nonché tra le diverse aree corticali combinando multi-elettrodo registrazioni elettrofisiologiche, imaging dell'attività neuronale (ad esempio, l'imaging intrinseca o estrinseca), e la stimolazione optogenetic. Inoltre, questa grande craniotomia espone anche una grande area di vasi sanguigni corticali, consentendo la manipolazione diretta della vascolarizzazione corticale laterale.

Introduzione

Craniotomia è una procedura standard utilizzato da neuroscienziati per rivelare una porzione del cervello. Sin dagli albori della elettrofisiologia, la craniotomia ha consentito innovazioni senza precedenti nel campo delle neuroscienze. mappatura densa della corteccia cerebrale con elettrodi ha portato ad ipotesi esperimenti di prova e teorie basate su queste mappe. Abbiamo recentemente entrati in una nuova era in cui la craniotomia è utilizzata per l'imaging in vivo del flusso sanguigno corticale 1, 2, 3 e architettura neurovascolari 4, permettendo la visualizzazione in tempo reale dell'attività corticale nelle aree esposte 5, 6, 7. Sebbene molti studi utilizzano craniotomie combinate con tecniche di imaging ottico in vivo per studiare la struttura e la funzione dei neuroni corticali, glia e corvascolarizzazione tici 8, 9, ulteriori indagini sono limitate da piccole aree della corteccia esposta (ma vedi 10).

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per creare una grande craniotomia laterali, esponendo la corteccia cerebrale dalla linea mediana all'osso squammoso, e si estende oltre bregma e lambda. Questa grande craniotomia consente la visualizzazione simultanea delle cortecce di associazione (retrosplenial, cingolo, e parietale), motoria primaria e secondaria, somatosensoriale, visivo, e la corteccia uditiva. Questo metodo è stato precedentemente accoppiato con immagini a colori sensibile tensione (VSDI) per indagare come più aree corticali interagiscono tra loro durante l'attività spontanea e stimolo indotto corticale 5, 11, 12. Gli aspetti più difficili di questa procedura include il posizionamento della testadell'animale, che fissa la piastra di testa, ed evitando emorragia mentre separa il muscolo temporale dall'osso parietale. Si deve inoltre tener conto durante i processi di foratura e di rimozione del cranio come le curve cranio ad un angolo obliquo.

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Protocollo

Il seguente protocollo segue l'Università del Comitato Animal Care Lethbridge (ACC) le linee guida, ed è condotta in conformità con gli standard del Consiglio canadese Animal Care (CCAC).

1. Preparazione

  1. Per periodi di tempo prolungati, autoclave tutte le forniture chirurgiche aperte e garantire che la sterilità viene mantenuta per tutta la chirurgia. Se sono necessari più interventi chirurgici, autoclave tra interventi chirurgici.
  2. Assicurarsi che ci sia un sacco di tampone cervello a portata di mano (almeno 50 mL). La soluzione è composta da 134 mM cloruro di sodio, 5,4 mM di potassio, 1 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 1,8 mM di cloruro di calcio diidrato, e 5 mM HEPES sodio, pH bilanciato a 7,4 con acido 5 M di idrogeno.
  3. Posizionare il mouse in una camera di induzione e anestetizzare con 3 - 4% isoflurano. Seguire con 1,0-2,0% isoflurano per la manutenzione durante l'intervento chirurgico. Ridurre ulteriormente a partire allo 0,4 - 0,8% durante l'imagingS = "xref"> 5 , 13 , 14 , 15 , a condizione che venga mantenuta un'anestesia adeguata. Questi bassi livelli di anestesia necessitano di monitoraggio vigile e frequente del mouse (circa ogni 5 min) per assicurarsi che rimangano muscolosi agli stimoli dolorosi.
    NOTA: La disidratazione può diventare problematica a causa dell'elevato rapporto tra superficie e volume del topo ed esacerbato dall'uso prolungato di isoflurano.
    1. Utilizzare iniezioni sottocutanee di soluzione salina, 0,1 ml per 10 g di peso corporeo, ogni 1 - 2 h. Quando opportunamente idratato, il mouse urinerà una volta ogni 1 - 2 h.
  4. Monitorare attentamente il mouse per garantire un'anestesia coerente durante l'intervento chirurgico e l'imaging. Non lasciare il mouse incustodito e prendersi cura di non riprendere mai la coscienza.
  5. Trasferire il mouse anestetizzato sul set di testa e posizionarlo su un pannello di riscaldamento termoregolatore impostato a 37 ° C. Fissare il tetto superioreh in un supporto denti.
  6. Ruotare la testa del mouse verso sinistra di circa 30 ° per esporre la parte laterale destra della testa e fissare la testa del topo con l'estremità smussata di barre orecchio (Figura 1A).
  7. Applicare una pomata oftalmica per evitare l'essiccazione della cornea.
  8. Per ridurre l'edema cerebrale, iniettare desametasone (4 mg / kg) per via intramuscolare.
  9. Pulire la pelle sopra l'area chirurgica con tamponi di cotone imbevuto 4% clorexidina (3 volte) e 70% di etanolo (3 volte). Utilizzare ogni tampone di cotone solo una volta.
  10. Munirsi di guanti chirurgici e coprire l'animale con la pellicola adesiva. Fornire anestetico locale iniettando di lidocaina (8 - 10 mg / kg; 2% epinefrina) per via sottocutanea sul sito craniotomia. Attendere 3-5 minuti per il farmaco di essere assorbito nel tessuto.

2. Rimozione della pelle e retrazione del muscolo dal cranio

  1. Eseguire quasi tutte queste procedure durante la visualizzazione del cranio, sotto undissezione microscopio (ad esempio, 0,7 - 4,5 x alimentazione, a seconda della situazione).
  2. Sollevare la pelle 1 mm a sinistra della linea mediana (appena dietro l'orecchio) con una pinza e fare una piccola incisione orizzontale con le forbici chirurgiche.
  3. Fare un 5 - taglio laterale 6 mm verso l'orecchio destro, e poi tagliare verso la fine rostrale della testa.
  4. Al punto di incisione iniziale, inserire le forbici e tagliare 10 mm rostralmente.
  5. Tagliare la pelle intorno l'orecchio destro, vicino l'occhio destro per esporre il lato destro del cranio e muscolo temporale. Assicurarsi che la parte più larga della zona esposta è di almeno 7 mm. Tagliare la pelle ulteriormente se l'area chirurgica deve essere estesa.
  6. Fissare la pelle intorno l'incisione mettendo alcune gocce di cianoacrilato colla butilica tra il cranio e la pelle. Garantire che il tessuto è stato preventivamente essiccato con applicatori di cotone punta o tessuti laminati per aumentare l'efficacia dell'adesivo.
  7. Usando un tampone di cotone, strofinare la superficiedel cranio in un movimento circolare per rimuovere il periostio dal cranio. Assicurarsi che nessuno rimanga asciugando completamente il cranio.
  8. Utilizzando forbici e pinze a molla, separare il muscolo temporale dal cranio; tagliare e ritrarre il muscolo lateralmente fino all'osso squammoso (Figura 1C). Prestare la massima attenzione a non danneggiare la vena temporale superficiale che costeggia il livello dell'osso squamosal vicino all'occhio, in caso contrario potrebbero verificarsi emorragia.
  9. Controllo emorragia con schiuma gel pre-impregnato in tampone cervello. Per grave emorragia utilizzare un cauterizer di calore. Goccia cianoacrilato colla butilica sui siti di sanguinamento dopo il trattamento con il calore cauterizer. Assicurarsi che l'area viene essiccato preventivamente mediante applicatori punta di cotone o tessuti laminati per aumentare l'efficacia dell'adesivo.

3. Craniotomia

NOTA: Il chirurgo deve rimanere diligente durante la rimozione del cranio eDura per evitare complicazioni inutili. Le procedure di risoluzione dei problemi sono incluse in caso di complicazioni.

  1. Segnare la posizione del bregma con un indicatore fine o tagliare un nastro piccolo pezzo triangolare e puntare un angolo a bregma ( Figura 2A ) per orientare le regioni del cervello sottostanti.
  2. Prima di apporre la testa, assicurarsi che il cranio sia completamente asciutto. Il cranio si asciuga rapidamente dopo l'applicazione della schiuma gel immersa nel tampone del cervello, se è necessario un maggiore essiccamento, utilizzare tamponi di punta di cotone. Questo passaggio è fondamentale per la fissazione della lastra di testa ( figura 1B ).
    NOTA: Se sul teschio rimane del periosteo o se il cranio non è asciutto prima di incollare sulla piastra di testa, probabilmente si stacca. Se ciò accade, rimuovere delicatamente la piastra di testa e ricominciare. Durante questo processo si può verificare il sanguinamento; Lasciare qualche minuto per coagulare e quindi togliere delicatamente. Questo processo non è raccomandato per essere ripetuto più di due volte.
  3. Applicare la colla etilcianoacrilato attorno al bordo inferiore della piastra di testa 16, ed incollare la piastra di testa sopra la zona craniotomia (Figura 1D e Figura 2A).
  4. Riempire lo spazio tra la piastra di apertura cranio e la testa con cemento dentale lasciando solo la zona craniotomia esposta. Attendere per il cemento dentale per asciugare e indurire, tipicamente 5 - 10 min (Figura 2B).
    1. Una volta che il cemento è impostato, brevemente riempire il pozzetto con tampone cervello e lasciare agire da 3 - 5 min. Utilizzare un tessuto laminato per rimuovere il tampone cervello prima perforazione (Figura 2C).
  5. Delineare l'area chirurgica con una leggera segnando la superficie del cranio con un trapano dentistico. Utilizzare un martello pneumatico (impostato al massimo di 20 PSI), con un FG ¼ bava, e controllato con un pedale velocità variabile.
  6. Delicatamente tracciare il trapano lungo il punteggio originale per approfondirla, eARANTIRE il trapano non penetra attraverso il cranio nel cervello (Figura 2D). A turno ogni pochi minuti tra foratura e tamponando la superficie del cranio con i tessuti laminati inumidite. Questo ridurrà il riscaldamento ed essiccamento del cranio da attrito meccanico ed esposizione prolungata.
    NOTA: Il cranio andrà in onda rapidamente asciutta dopo l'applicazione della schiuma gel bagnato. Se è necessario più di essiccazione, utilizzare tamponi di cotone punta.
    Attenzione: Il cranio è uniforme di spessore. Ad esempio, la cresta parietale-temporale è la zona più spessa, mentre le regioni cranio vicino alla linea mediana e monumenti squammoso sono relativamente sottili.
  7. Durante la perforazione, controllare periodicamente per deformazione del cranio premendo delicatamente su di esso con una pinza o la punta del trapano non in movimento. Quando l'osso inizia a fibbia, smettere di foratura e immergere l'intera finestra in un tampone cervello.
    NOTA: Se il sangue si precipita fuori di una zona, si può suggerire che la dura madre è stata danneggiata. Se questo è il caso, inserire un semi-bagnato schiuma gel sull'area e cercare di assorbire il sangue mentre delicatamente applicando pressione alla schiuma gel con un tampone di punta di cotone.
  8. Attendere almeno 5 minuti prima della rimozione del cranio per ammorbidire l'osso e per ridurre la possibilità di attaccare la dura fino all'osso, rendendo il processo di rimozione del cranio più facile.
  9. Eseguire il processo di rimozione del cranio, mentre il cranio è immerso in un tampone cervello.
    NOTA: Se una parte del cranio rimane ostinatamente attaccato, una lama di bisturi # 11 può essere utilizzato per segnare delicatamente il cranio. Prestare la massima attenzione a non forare la lama attraverso il cranio e nel cervello.
  10. A partire dal bordo anteriore, sollevare delicatamente il cranio allentato dalla dura madre con pinze.
    NOTA: se una piccola quantità di sanguinamento si verifica durante il processo di rimozione del cranio, rimuovere il buffer con una pipetta di trasferimento o una siringa, e poi sostituirlo con nuovo buffer.
  11. Una volta che l'osso è allentata e "galleggiare" sulla dura, afferrare saldamente l'osso con una pinza e sollevare l'osso dallala dura madre. Assicurarsi che l'osso non penetra nel cervello.
  12. Per controllare il sanguinamento, rotolare l'angolo di un tessuto in un punto e rimuovere la maggior parte del buffer dal pozzo cranica. applicare rapidamente schiuma gel, pre-impregnato in un tampone, per la zona sanguinante aggiungendo pressione molto leggera con un tampone di punta di cotone.
    NOTA: Il sanguinamento di solito proviene da bordo del osso o la superficie della dura; entrambi i casi sono normali e sanguinamento si fermeranno rapidamente se senza grandi vasi sanguigni sono danneggiati. Se l'emorragia continua, il sangue può riempire l'intera finestra, formare un foglio coagulo sopra l'area di esposizione.
    1. Per rimuovere il foglio di coagulo, accuratamente raccogliere pezzi di sangue coagulato dalla area di esposizione, lasciando intatto il coagulo di sangue attorno alla fonte del vaso sanguigno rottura. Fare attenzione a non rimuovere il coagulo di sangue dalla sorgente di spurgo in quanto ciò potrebbe causare ancora più perdita di sangue. Irrigare la superficie del cervello con tampone cervello per lavare via il sangue.
    2. Fare attenzione a non toccare iltessuto cerebrale delicato o aggiungere materiale estraneo al cervello; ripetere fino emorragia si è fermata, per circa 2 - 5 minuti (figura 2E).
      NOTA: A questo punto, la craniotomia è pronto per la preparazione della finestra del cranio (vedi punto 5). Se necessario, rimuovere la dura prima di impiantare la finestra del cranio (vedi punto 4).

4. Rimozione Dura

NOTA: la rimozione Dura richiede estrema attenzione e può richiedere oltre 15 min.

  1. Disegnare via il tampone in eccesso dalla craniotomia. Pur mantenendo una superficie umida, afferrare un piccolo pezzo di dura con una pinza e strappare delicatamente la dura.
  2. Utilizzare pinze e forbici molla strappare delicatamente e tagliare via la dura.
  3. Goccia più tampone cervello sulla superficie del cervello galleggiare la dura e aiutare separato dal cervello. Continuare fino a quando tutto dura viene rimosso dal sito finestra del cranio. Quando eseguito correttamente apparirà il cervello a essere molto pulito con bl distintanavi OOD e senza macchie (confrontare figura 2E con 2F).
    Attenzione: Alcune aree della dura madre sono attaccati alle piccole arteriole sulla superficie del cervello (per esempio, vicino alla linea mediana prossimale alla zona associazione parietale), e la rimozione di tale possono rompersi arteriole. In questi casi, può essere meglio lasciare un piccolo pezzo di dura intatta sopra la parte superiore della arteriole. Il VSD non può penetrare quella piccola zona, ma questo è preferito avere sanguinamento maggiore.
  4. Fissare la superficie del cervello in agarosio appena possibile per ridurre al minimo il movimento da pulsazione e prevenire ulteriore rigonfiamento (vedere la fase 5).

5. Preparazione cranica finestra

  1. Spruzzare il vetro di copertura con il 70% di etanolo e utilizzare una bombola d'aria per asciugare delicatamente. Assicurarsi che il vetro sia completamente pulita senza macchie o polvere presente.
  2. Preparare 1,3% agarosio mediante riscaldamento a 200 mg di polvere di agarosio disciolti in 15 mL di tampone cervello. Impostare il forno a micrave ad alta e calore per 10 - 15 s per volta, mescolando delicatamente in mezzo, fino a quando tutti agar è disciolto.
    Nota: Assicurare bolle o particelle sono presenti in quanto potrebbero interferire con l'imaging.
  3. Posizionare un termometro nel agarosio caldo e raffreddare l'agarosio fino a poco sopra solidificazione di temperatura (~ 40 ° C).
    NOTA: Acqua corrente fredda sopra la parte esterna del contenitore agarosio può accelerare il processo di raffreddamento. Delicatamente mescolare continuamente per garantire l'assenza di bolle o in presenza di particolato.
  4. Immediatamente prima di applicare l'agar, rimuovere il buffer cervello dal pozzo cranica. Redigere l'agarosio con una pipetta di trasferimento e rilasciare l'agarosio direttamente sul cervello. posizionare rapidamente il vetrino sulla superficie e fissare il vetrino con agarosio gocce sugli angoli.

6. eutanasia

NOTA: i chirurghi Nella nostra esperienza, questa procedura richiede sperimentato almeno 3 - 4 ambulatori di pratica per raggiungere più del 90%tasso di successo. Meno chirurghi esperti potrebbero richiedere ancora più pratica. Durante la craniotomia o durotomia, il cervello può subire danni, come ad esempio se i punzoni di perforazione attraverso l'osso nel cervello. Certo danno minore al bordo della craniotomia può essere consentita. Tuttavia, se il cervello non ha un aspetto "pulito" con brillanti vasi sanguigni intatti rossi e la corteccia bianca, l'esperimento può avere bisogno di essere terminato. Esempi di preparazioni povere includono quelli con i vasi sanguigni morti, o quando la corteccia è contrassegnata con vasi sanguigni strappati o danneggiati. Se uno qualsiasi di questi segni sono presenti, l'esperimento sarà improbabile produrre dati di alta qualità. Se l'intervento chirurgico / esperimento ha avuto successo o meno, umanamente eutanasia il mouse al termine dell'esperimento.

  1. Profondamente anestetizzare con almeno il 3,5% isoflurano. Quindi, dare un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a 300 mg / kg. Idealmente, se l'ago viene inserito nel fegato, morte sarà molto rapida (<1 min).
  2. Se è richiesta la perfusione, verificare che l'animale è anestetizzato profondamente prima di procedere (vedi passo 1.3).
  3. In alternativa, se la perfusione non è richiesto, attendere un minimo di 5 min e quindi verificare che il mouse è morto. Confermare l'assenza di respirazione, battito cardiaco, così come la mancanza di recesso dolore e riflessi corneali. Inoltre, per osservare azzurro / colorazione bianco di estremità e oscuramento dei vasi sanguigni sulla corteccia.

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Risultati

Per studiare le interazioni tra le aree corticali all'interno di un singolo emisfero, abbiamo usato un ampio craniotomia estende attraverso il seno sagittale e 5 - 6 mm lateralmente. Questa finestra cranica inclusa primaria (motore, somatosensoriale, visivo, uditivo), secondari (motore, visivo), e di associazione (retrosplenial, cingolo, parietale associazione) cortecce di emisferi destro (Figura 3A). Per questo lavoro abbiamo utilizzato l'imag...

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Discussione

Questo protocollo innovativo per una grande finestra cranica permette l'imaging simultaneo sulle zone temporali e parietali della corteccia cerebrale. Combinato con imaging ottico, può aiutare a rivelare dinamiche neurali all'interno di aree corticali durante l'attività spontanea e stimolo-indotta. Questo craniotomia espansiva espone anche una grande estensione della rete vascolare corticale, tra cui l'estremità prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA), consentendo imaging in vivo del f...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un consiglio scientifico di ricerca scientifica del Canada (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta per l'Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer Research Program a MHM e NSERC CREATE in borsa di dottorato BIF e borsa di studio post-laurea AIHS a MK. Ringraziamo Pu Min Wang per lo sviluppo di questo protocollo e per la formazione chirurgica, e Behroo Mirza Agha e Di Shao per la carriera.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TermoforoFHC40-90-2
Forbici finiStrumenti per la scienza fine14058-09
Pinze Fine Science Tools11251-35Si consigliano 2 o più paia
Forbici a mollaFine Science Tools15000-00, 15000-101 paio deve essere designato per la rimozione della dura dura 
Polvere per il colore dei denti a gettoLANG DentalJet Polvere per il colore dei dentida miscelare con il liquido Jet Jet
per dentiLANG DentalJet Tooth Shade Liquidda miscelare con la polvere a getto 
Teste di perforazione - Frese in metallo duro FG 1/4 389Midwest Dental385201
Polvere di agarosioSigma-AldrichA9793
GelfoamSinclair Dental CanadaPfizer Gelfoam
IsofluraneWestern Drug Distribution Centre Ltd124125
Lidocaina 2% EpinefrinaWestern Drug Distribution Centre Ltd125299
Desametazone 5  mg/mLWestern Drug Distribution Centre Ltd125231
Colla cianoacrilato butilico (VetBond)Western Drug Distribution Centre Ltd12612
a getto d'acqua

Riferimenti

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