L'identificazione luminescente di elementi funzionali in 3' regioni non tradotte (3'UTR) (3'LIFE) è una tecnica per identificare la regolazione funzionale nei 3'UTR da parte di miRNA o altri fattori regolatori. Questo protocollo utilizza una metodologia ad alto rendimento, come la trasfezione a 96 pozzetti e i saggi di luciferasi, per lo screening di centinaia di interazioni putative per la repressione funzionale.
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Articolo metodologico
Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3'LIFE
In questo articolo
Sommario
Abstract
Luminescente Identificazione di elementi funzionali a 3'UTRs (3'LIFE) permette la rapida identificazione di bersagli di miRNA specifici all'interno di un array di centinaia di 3'UTRs interrogati. Identificazione di destinazione è basato sul dosaggio dual-luciferasi, che rileva vincolante a livello di mRNA misurando uscita traslazionale, dando una lettura funzionale miRNA targeting. 3'LIFE utilizza i buffer non proprietari e reagenti, e biblioteche giornalista pubblicamente disponibili, rendendo gli schermi genome-wide fattibile e conveniente. 3'LIFE può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard o scalato utilizzando robot gestione dei liquidi e altra strumentazione high-throughput. Illustriamo l'approccio con un set di dati di 3'UTRs umani clonati in piastre a 96 pozzetti e due miRNA test, lasciamo-7c e miR-10b. Dimostriamo come eseguire preparazione del DNA, trasfezione, coltura cellulare e saggi di luciferasi in formato 96-bene, e di fornire gli strumenti per i datianalisi. In conclusione 3'LIFE è altamente riproducibile, veloce, sistematico, e individua gli obiettivi alti di fiducia.
Introduzione
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di individuare e mappare con precisione microRNA target (miRNA) in high-throughput. MiRNA sono endogeni RNA non codificanti ~ 22 nucleotidi di lunghezza. In seguito la trascrizione e la lavorazione, miRNA maturi sono incorporati in un complesso proteico chiamato RNA induced silencing complex (RISC). Ogni miRNA guida il RISC ad elementi situati principalmente nelle regioni 3'untranslated (3'UTRs) di RNA messaggeri (mRNA) di destinazione, con conseguente sia repressione traduzione o mRNA cleavage 1. Mirna riconoscere siti di destinazione basate su standard di Watson-Crick e G: U Wobble appaiamento de....
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Protocollo
1. coltura cellulare (24-48 ore prima della trasfezione)
- 24-48 hr prima di seme trasfezione quantità sufficiente di cellule HEK293T base al numero di piastre a 96 pozzetti essere trasfettate.
NOTA: Per trasfezioni coerenti, cellule piastra ad una densità sufficiente per favorire una rapida divisione, ma non essere a più del 70-90% di confluenza al momento della transfezione. - Ogni piastra a 96 pozzetti richiede 9 x 10 6 cellule (75.000 cellule per bene, e 120 pozzi per piastra per tenere conto per l'utilizzo di serbatoio e pipetta multicanale). Calcolare il tempo di raddoppio delle cellule HEK293 (tipicamente ~ 20 hr), ....
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Risultati
Il file di output luminometro contiene misure prime per entrambe le proteine luciferasi lucciola e Renilla. Questo formato raw è compatibile con il "3'LIFE - analisi piatto unico" e "3'LIFE - analisi multidisco" fogli di calcolo disponibile sul sito web laboratorio Mangone ( www.mangonelab.com ). Il singolo analisi piatto foglio elettronico calcola automaticamente lucciola / rapporto Renilla, normalizza ogni miRNA al controllo negati.......
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Discussione
Il test 3'LIFE identifica obiettivi funzionali miRNA in 3'UTRs a high-throughput. Questo test è utile per i ricercatori che desiderano identificare sperimentalmente un gran numero di bersagli putativi per la loro miRNA di interesse. Il saggio 3'LIFE è un approccio potente per eseguire query per 3'UTR regolazione guidata, in quanto il test fornisce una misura funzionale di miRNA targeting e la sperimentazione binario di un singolo giornalista :: 3'UTR contro un singolo miRNA può tranquillamente affron.......
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Dichiarazioni
Questo lavoro è supportato da fondi del College of Liberal Arts and Science e del Biodesign Institute dell'Arizona State University e dal NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.
Ringraziamenti
Ringraziamo Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer per i consigli e le discussioni. Karen Anderson, John Chaput e Josh LaBaer per la condivisione di reagenti e strumentazione, Michael Gaskin e Andrea Throop per i consigli tecnici e i protocolli. Justin Wolter è uno studioso di Maher e ringrazia la famiglia Maher per il loro generoso sostegno.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| glicilglicina | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferina | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Celeterazina | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilina/Streptomicina | Sigma | P4333 | |
| Tripsina | T2600000 | ||
| Materiali di consumo | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| Piastra miniprep a 96 pozzetti | Pall | 8032 | |
| Piastre shuttle a 96 pozzetti | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Tampone di lisi | Promega | E1941 | |
| Strumenti | |||
| Lettore di piastre GloMax a 96 pozzetti | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| Unità centrale a 4 nucleofori | Lonza | AAF-1001 | |
| Sistema navetta a 96 pozzetti | Lonza | AAM-1001 | |
| Contatore di celle Countess | Invitrogen | Codice: C10227 |
Riferimenti
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (680....
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Ristampe e permessi
