Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l'espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).
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Articolo metodologico
L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Iniezione stereotassica è una tecnica utile per fornire lentivirus ad alto titolo di aree cerebrali mirati nei topi. Lentivirus possono sia iperespressione o espressione genica atterramento in una regione relativamente concentrato, senza danni significativi al tessuto cerebrale. Dopo il recupero, il mouse iniettato può essere testato su vari compiti comportamentali come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST). L'OFT è progettato per valutare locomozione e il fenotipo ansia nei topi misurando la quantità di tempo che trascorre un topo nel centro di un campo aperto romanzo. Un topo più ansioso spenderà molto meno tempo nel centro del campo romanzo rispetto ai controlli. La FST valuta il fenotipo antidepressivo quantificando la quantità di tempo che i topi trascorrono immobile, quando sono immessi in un secchio d'acqua. Un mouse con un fenotipo antidepressivo spenderà molto meno tempo rispetto immobile agli animali di controllo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la STERiniezione eotactic di un lentivirus, in combinato disposto con test comportamentali per valutare come i fattori genetici modulare comportamenti animali.
Introduzione
Il mouse è stato ampiamente utilizzato in neurobiologia perché è facile da manipolare geneticamente. Tecniche di Gene knockout permettono ai ricercatori di indagare come ogni fattore genetico dà forma comportamenti del mouse. Inoltre, il sistema cre-loxP fornisce uno strumento prezioso per tessutale e Cell tipo- knockout gene specifico nei topi, che consente ai ricercatori di studiare la funzione dei geni in diversi tessuti. 1 Tuttavia, in pratica, i modelli di espressione dei promotori CRE sono difficili da controllare , e finora molti driver cre stabiliti non hanno raggiunto l'espressione specifica regione. 2,3
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Protocollo
NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati rilevati in conformità con le linee guida per la cura degli animali di The Pennsylvania State University, IACUC # 44057
1. Lentivirus Produzione
NOTA: Il giorno prima transfezione, LentiX-293 cellule dovrebbe essere al 80% di confluenza.
- Lavare le cellule con DMEM appena prima trasfezione e incubare in 10 ml di DMEM / 10% FBS con penicillina (100 UI / ml) e streptomicina (100 ug / ml) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Diluire DNA e polietilenimmina (PEI) (1 mg / ml) in rapporto 1: 3 (1 mg di DNA: 3 ml di PEI) in 1 ml di DMEM e vortex per 1 ....
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Risultati
Iniezione stereotassica accurata si basa molto su come impostare le coordinate corrette. La punta dell'ago utilizzato per iniettare il virus dovrebbe essere impostato direttamente sull'intersezione di bregma e la linea intraurale (Figura 1). È utile utilizzare uno stereomicroscopio di accertare se l'ago è posizionato correttamente. Quando guardando attraverso il microscopio, l'ago deve essere posizionato in modo che se il virus è stato iniettato, sarebbe atterrare direttamente sull.......
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Discussione
Iniezioni stereotassica di successo si basano su tre fattori: tenere il mouse viva, impostando il corretto punto zero per le coordinate (punta dell'ago sull'intersezione di bregma e la linea interaurale), e impostando la giusta profondità al punto zero (punta dell'ago sfiora l'esterno del tessuto cerebrale). La vitalità dei topi è importante. Sopravvivenza chirurgia può essere aiutata da fare in modo che il mouse sia correttamente anestetizzato e riceve adeguata analgesico. Il dolore è noto per essere un.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato in parte dall'American Heart Association Scientist Development Grant e dal NARSAD Young Investigator Award a Yingwei Mao.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Apparecchio stereotassico articolo 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Pompa stereotassica per eccellenza | Stoelting co. | 53311 | |
| Iniezione Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Poliscienze Inc. | 23966 | |
| Forbici | Strumenti chirurgici fini | 14084-08 | |
| Pinze con estremità smussate | Strumenti chirurgici fini | 11002-12 | |
| Porta aghi | Strumenti chirurgici fini | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Scatola di controllo Microtorque, manipolo Tech2000 | con pedale |
| Sterilizzatore a perle di vetro Inotech | IS-400 | ||
| Suture riassorbibili | Unify | M-K518r19 | Assorbente, taglio inverso |
| Tamponi di cotone | VWR | 89031-270 | |
| Termoforo | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Lacrime artificiali | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Siringa monouso | 309623 | Siringa BD | |
| stoffa | |||
| nbsp; | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin o altro anestetico | vedi ricetta citazione | ||
| Ketoprofene o altro analgesico | vedi veterinario | ||
| Software di tracciamento | Noldus | Ethovision XT | |
| Telecamera di tracciamento | Noldus | Media Recorder |
Riferimenti
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al.
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Ristampe e permessi
