I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.
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Articolo metodologico
Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Bone è la sede più comune di metastasi del cancro al seno. Anche se è ampiamente accettato che il comportamento delle cellule di cancro influenze microambiente, poco si sa circa le proprietà delle cellule del cancro al seno e comportamenti all'interno del microambiente nativo del tessuto osseo umano. Abbiamo sviluppato approcci per monitorare, quantificare e modulare le cellule del cancro al seno umano nel microambiente di frammenti umani in coltura di tessuto osseo isolati da teste femorali scartati seguenti totali interventi chirurgici di sostituzione dell'anca. Usando le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) espressione, siamo in grado di quantificare in modo riproducibile di migrazione e proliferazione modelli che utilizzano l'imaging bioluminescenza (BLI), interazioni cellulari pista entro i frammenti ossei mediante microscopia a fluorescenza, e valutare le cellule del seno dopo colonizzazione con citometria a flusso. I vantaggi principali di questo modello sono: 1) un nativo, MicroE tessuto architettonico intattonvironment che include importanti tipi di cellule umane, e 2) l'accesso diretto al microambiente, che facilita la rapida quantitativa e monitoraggio qualitativo e perturbazione del seno e delle cellule delle ossa proprietà, comportamenti e interazioni. Una limitazione primaria, attualmente, è finita la vitalità dei frammenti di tessuto, che delimita la finestra di studio per coltura breve termine. Applicazioni del sistema modello comprendono lo studio della biologia di base di cancro al seno e di altri tumori maligni ossa cerca all'interno della nicchia metastatica, e lo sviluppo di strategie terapeutiche per indirizzare in modo efficace le cellule del cancro al seno nei tessuti ossei.
Introduzione
Il microambiente tumorale è ampiamente riconosciuto come un fattore determinante del comportamento delle cellule di cancro durante la progressione del cancro al seno e metastasi diffuse 1-3. L'obiettivo del metodo presentato qui è quello di facilitare lo studio delle cellule del cancro al seno nel microambiente del tessuto osseo umano, la sede più frequente di cancro al seno metastasi 4-6. Bone comprende mineralizzati e midollo compartimenti 7-9, entrambe ospitano cellule e fattori secreti implicati nella progressione metastatica 10,11. Benché ampiamente utilizzato in modelli di topo vivo facilitare st....
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Protocollo
Teste femorali sono stati prelevati da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva THR presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Stanford. Tutti i tessuti sono stati raccolti come campioni de-identificati conformemente ai regolamenti della ricerca dell'Ufficio Compliance Stanford University.
1. Selezione di un cancro al seno linea cellulare (s)
- Ottenere o trasfettare linea di cellule di cancro al seno desiderata (s) con una luciferasi-GFP giornalista costrutto. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il MCF-7 di cancro al seno linee cellulari progettati per l'espressione ....
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Risultati
Isolare frammenti di tessuto da femorali Heads
Teste femorali sono stati raccolti da un numero uguale di pazienti di sesso femminile (44-90 anni di età) sottoposti a chirurgia elettiva di sostituzione totale dell'anca presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell'Università di Stanford maschile e. Ogni testa femorale scartato contiene una piccola porzione del femore, che porti tessuto osseo trabecolare composto spicole mineralizzati e osseo. Questo.......
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Discussione
Mehra et al. Hanno descritto in precedenza la raccolta e l'analisi di campioni ossei postmortem di pazienti affetti da carcinoma prostatico metastatico raccolte al momento dell'autopsia, rivelando i tessuti di alta qualità e per validare l'uso di campioni di ossa umane per studiare il processo metastatico 47. Qui abbiamo descritto i protocolli per la raccolta, l'elaborazione e l'utilizzo di frammenti di tessuto osseo umano ottenuti da teste femorali scartati dopo l'intervento .......
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Dichiarazioni
Nessuna divulgazione da segnalare.
Ringraziamenti
Questi studi sono stati finanziati, in parte, da finanziamenti della ricerca e sviluppo della Fondazione alternativa (107.588), l'Istituto Nazionale della Salute (1U54CA136465-04S1), e la California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Ringraziamo Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor per la generosa donazione di loro transponson e PK / hUbiC-SB11 plasmidi trasposasi. Noi riconosciamo con gratitudine John Tamaresis, Ph.D. per consigli su metodi statistici, Timothy Brown per l'esecuzione di citometria a flusso, Georgette Henrich per consigli su migrazioni saggi, e Nancy Bellagamba per facilitare la raccolta di campioni THR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Integrare tutto il DMEM con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Integrare tutti i McCoy's con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di Pen/Strep |
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidina (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Terreni supplementari utilizzati per linee cellulari trasfettate. |
| Falco Inserti per colture cellulari per piastre a 24 pozzetti con membrana in PET trasparente (8.0 μ Inserto | |||
| Kit di vitalità/citotossicità LIVE/DEAD *per cellule di mammifero* | Tecnologie di rilevamento di invitrogeni | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferina lucciola, sale di potassio 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Filtro cellulare sterile 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Cluster di colture cellulari trattate con TC a 6 pozzetti | Corning Incorporated | 3516 | |
| Cluster di colture cellulari trattate con TC a 12 pozzetti | Corning Incorporated | 3513 | |
| Cluster di colture cellulari trattate con TC a 24 pozzetti | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Cera ossea | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Piattaforma di imaging | Calibro Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Versione 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 cellule di cancro al seno | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 cellule di cancro al seno | ATCC | HTB-26 | |
| Citocheratina monoclonale di topo anti-umana anticorpo | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
Riferimenti
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227(2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9<....
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Ristampe e permessi
