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Articolo metodologico

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion

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DOI:

10.3791/52681

⸱

9 aprile 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

In questo articolo

Sommario

C. elegans è un modello utile per studiare gli effetti dell'etanolo sul comportamento. Presentiamo un saggio comportamentale che quantifica gli effetti dell'etanolo sulla velocità di locomozione dei vermi striscianti; sia la sensibilità iniziale che lo sviluppo di una tolleranza funzionale acuta all'etanolo possono essere misurati con questo saggio.

Abstract

I disturbi da uso di alcol sono una preoccupazione significativa per la salute pubblica, per la quale ci sono poche strategie di trattamento efficaci. Una difficoltà che ha ritardato lo sviluppo di trattamenti più efficaci è la relativa mancanza di comprensione delle basi molecolari degli effetti dell'etanolo sul comportamento. Il nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), fornisce un modello utile in cui generare e testare ipotesi sugli effetti molecolari dell'etanolo. Qui, descriviamo un saggio che è stato sviluppato e utilizzato per esaminare i ruoli di particolari geni e fattori ambientali nelle risposte comportamentali all'etanolo, in cui la locomozione è l'output comportamentale. L'etanolo provoca in modo dose-dipendente una depressione acuta del movimento strisciante su una superficie di agar. Gli effetti sono dinamici; gli animali esposti ad una alta concentrazione dimostrano una iniziale forte depressione del movimento strisciante, qui definita sensibilità iniziale, e poi recuperano parzialmente la velocità di locomozione nonostante la continua presenza del farmaco. Questa plasticità comportamentale indotta dall'etanolo è qui definita sviluppo della tolleranza funzionale acuta. Questo saggio è stato utilizzato per dimostrare che questi due fenotipi sono distinti e geneticamente separabili. Il saggio di locomozione semplice qui descritto è adatto per esaminare gli effetti di manipolazioni genetiche e ambientali su queste risposte comportamentali acute all'etanolo in C. elegans.

Introduzione

I disturbi da uso di alcol (AUD) sono diffusi e producono gravi problemi di salute, sociali ed economici. Negli esseri umani, la suscettibilità a sviluppare un AUD è fortemente influenzata sia dalla genetica che dall'ambiente1,2. Un forte predittore fisiologico della propensione all'abuso è il livello iniziale di risposta (LR) all'alcol (etanolo) che viene mostrato dai bevitori inesperti3-5. Questo fenotipo di LR è influenzato da componenti genetiche e non genetiche6. Determinare i meccanismi molecolari che influenzano la LR all'etanolo è un obiettivo importante dello studio dei comportamenti di risposta all'etanolo.

Il nematode, Caenorhabditis elegans, è stato sempre più utilizzato come modello per studiare gli effetti dell'etanolo sul comportamento7-9. C'è una forte conservazione molecolare nella macchina del funzionamento del sistema nervoso tra vermi e mammiferi, e diversi geni che hanno dimostrato di influenzare la LR all'etanolo nei vermi hanno dimostrato di influenzare la LR all'etanolo nei mammiferi10-16, e sono stati implicati nella propensione all'abuso negli esseri umani17-19.

L'etanolo intossica i vermi, il che si riflette in una diminuzione della loro velocità di locomozione. Diversi laboratori hanno sviluppato test comportamentali che differiscono in diversi modi, ad esempio, il comportamento di locomozione che studiano (strisciare versus nuotare11,12,14,20,21) o nella composizione delle soluzioni in cui vengono eseguiti i test (terreno di crescita dei nematodi versus soluzione salina di Dent20,22). È interessante notare che questi diversi test hanno prodotto profili di risposta alla dose leggermente diversi per gli effetti dell'etanolo. Questi risultati hanno indicato importanti differenze nei comportamenti sottostanti dello strisciare e del nuotare9,23, nonché un ruolo della variabile ambientale osmolarità nelle risposte all'etanolo20, e hanno evidenziato l'importanza di descrivere i dettagli sperimentali dei vari test.

Qui viene presentato un test per misurare gli effetti acuti dell'etanolo sul comportamento di strisciamento. Questo test è stato ampiamente utilizzato per studiare le influenze genetiche e ambientali sulla LR all'etanolo8,10,20,24,25. Il fenotipo LR nei mammiferi è un composito di almeno due componenti, sensibilità iniziale all'etanolo e tolleranza funzionale acuta all'etanolo26,27. Nei vermi, il fenotipo LR è stato dimostrato essere separabile in questi due componenti attraverso l'uso di questo test comportamentale. Le influenze delle manipolazioni genetiche e ambientali su entrambi i fenotipi possono essere esaminate utilizzando questo singolo test. È importante sottolineare che questi due fenotipi sono geneticamente separabili.

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Protocollo

1. procedura per eseguire il giorno prima del test

  1. Scegli L4 vermi stadio a fresco mezzo di crescita nematode (NGM) piastre seminate con un prato di OP50 E. coli, e la cultura a 20 CO / N. Ogni condizione test richiede 10 vermi; scegliere un eccesso di vermi per consentire O / N perdita di vermi.
    1. Animali solo test che sono gli adulti del primo giorno; molti mutanti crescono a una velocità più lenta di tipo selvaggio. Regolare i tempi di raccolta per i ceppi che hanno ritardi di sviluppo in modo che tutti gli animali testati sono adulti primo giorno.

2. procedura per eseguire il Giorno del saggio

  1. Preparazione per il saggio:
    1. Effettuare test su 60 x 15 millimetri piastre non teste di serie standard di NGM. Asciugare tutti piatti da utilizzare a 37 ° C per 2 ore, con coperchio off. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM secchi; questi saranno gli 0 e 400 mm piastre test etanolo e i loro piatti di acclimatazione di accompagnamento.
      NOTE:L'uso di piastre NGM è importante; differenze nella composizione delle piastre, in particolare la loro osmolarità, possono influenzare fortemente la risposta dose di etanolo sul comportamento, ciò è dovuto, almeno in parte, ai cambiamenti nella quantità di etanolo accumulata dagli animali 20. NGM agar è di 160 mOsm.
    2. Dopo l'essiccazione, pesano ciascuna delle piastre NGM non teste di serie da utilizzare nel dosaggio e nota il peso. Determinare il volume del supporto nelle piastre base al peso di un piatto vuoto. Per approssimare la conversione del peso del agar a volume, si supponga che il supporto pesa la stessa di un uguale volume di acqua.
      NOTA: I nostri risultati più consistenti sono stati trovati con i media NGM che ha disidratati sufficientemente che un volume originale 10 ml ha un volume di post-essiccazione tra 8,3-8,9 ml. Un'alternativa al tempo secco 2 hr è asciugare le piastre fino a raggiungere questa gamma volume per tenere conto delle differenze in incubatrici.
    3. Sciogliere 4 anelli di rame (diametro interno di 1.6 cm) nella superficie di ciascuna delle piastre di agire come recinti per i diversi genotipi o gruppi di trattamento di worms.Grasp ogni anello con una pinza, e calore in una fiamma (forte fiamma di un becco Bunsen funziona bene) per circa 3 sec. Porre immediatamente l'anello su un piatto, mentre ancora in mano l'anello con le pinze per evitare che 'saltare'.
      1. Assicurarsi che l'anello poggia piatta contro la superficie del agar premendo leggermente con la pinza in diversi punti sull'anello. Quando si posiziona l'anello, attenzione a lasciare spazio per altri tre anelli.
      2. Sciogliere i tre anelli di rame aggiuntivi nella superficie della piastra, avendo cura di posizionare il più vicino possibile tra loro in modo che tutti e quattro sarà nel campo visivo della telecamera.
        NOTA: Fare una buona tenuta con l'agar è essenziale per mantenere i vermi negli anelli durante il dosaggio. Anelli che saltano intorno sul piatto è improbabile che rendere la tenuta corretta con l'agar epuò cicatrice l'agar, che permette vermi scavano e interferisce con la visualizzazione dei vermi.
      3. Per ogni piatto saggio preparare un piatto di accompagnamento "acclimatazione", che dovrebbe essere essiccata e testa di serie e riceverà nessun etanolo. Mettere quattro anelli di rame su queste tavole.
    4. Etichettare il fondo delle piastre adiacenti anello con il ceppo vite senza fine per essere utilizzato nell'anello, avendo cura di non scrivere nel campo visivo dell'anello stesso. Far corrispondere le etichette sulla piastra test con la piastra di acclimatazione di accompagnamento.
    5. Calcolare la quantità di etanolo al 100% da aggiungere a ciascuna piastra di test in modo che la concentrazione finale è 0 mM o etanolo mM 400 (peso a volume). Per ogni esperimento (n = 1), ci sarà un 0 mM ed una piastra 400 mM etanolo; piastre acclimatazione non ricevono etanolo. Aggiungere l'etanolo, pipettando intorno alla superficie della piastra. Utilizzare pellicola di laboratorio per sigillare la piastra e lasciarlo equilibrare sul banco per 2 ore.
    6. Trascorso 1,5 ore, iniziare la fase di acclimatazione del dosaggio, passo 2.2.
  2. Eseguire test locomozione: lastre Assay
    1. Trasferire accuratamente 10 vermi di ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra acclimatazione. Rimuovere qualsiasi alimento che è visibile sull'agar a questo punto raschiando delicatamente con il pick verme. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali sono messi sulle piastre attraverso prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non vengono messi sulle piastre nello stesso ordine in tutti gli studi.
      NOTA: L'obiettivo è quello di trasferire gli animali alla piastra con quantità minime di cibo, perché se cibo sul piatto acclimatazione viene trasferito alla piastra di dosaggio i vermi aggregare attorno al cibo e l'effetto del farmaco sulla locomozione sarà oscurata.
    2. Fare attenzione a non rompere la superficie del agar con il plettro, in quanto questo permetterà ai vermi di tana e interromperà il dosaggio. Incubare i vermi a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Assicurarsi che vi sia un intervallo adeguato tra le iniziazioni di ogni piatto. Uno sperimentatore esperto può muovere 40 animali, 10 / anello per 4 anelli in <1,5 min, ma qualunque intervallo fino a 2 minuti è accettabile. Il test standard è la registrazione di filmati a 10-12 min e 30-32 minuti di esposizione sia per 0 mm e 400 mm di etanolo.
    4. Avviare la piastra acclimatazione per l'esposizione 0 mm e la piastra di acclimatazione per l'esposizione 400 mm circa 2 min e 30 sec a parte per consentire il risparmio del primo filmato prima del secondo filmato deve iniziare.
    5. Dopo il periodo di acclimatazione di 30 min, trasferire i vermi dalle piastre acclimatazione alle piastre di saggio. Trasferire i vermi alle piastre di saggio (0 mM o etanolo 400 mM) nello stesso ordine in cui sono stati aggiunti alla piastra acclimatazione, tenere traccia del tempo tra i completamenti di ogni piastra. Sigillare la piastra con la pellicola di laboratorio per minimizzare la perdita di etanolo per evaporazione.
    6. USE un movimento scavare con un pick verme sottile taglio appiattito per raccogliere i vermi in cima alla scelta appiattito. Eseguire il trasferimento di vermi dalla piastra acclimatazione unseeded alla piastra dosaggio senza l'uso di batteri, che è comunemente usato nel trasferimento vermi quanto contribuisce a incollare il verme al ritiro.
      NOTA: La velocità alla quale gli animali vengono trasferiti in questo passaggio è molto importante perché le prime vermi sulla piastra saranno esposti ad etanolo più lungo degli ultimi vermi aggiunti alla piastra, e precedenti punti di tempo può mostrare alcuni effetti dipendenti dal tempo. Questa è la ragione principale per la quale i ceppi rotazione sono posti su una piastra prima attraverso repliche sperimentali.
  3. Eseguire Locomotion Assay: riprese
    1. Utilizzare una combinazione microscopio / macchina che permette l'imaging simultaneo di tutti i quattro anelli nel campo visivo (42x42 mm 2 circa quadrata), ad esempio un obiettivo microscopio 0.5x, 0.8x ingrandimento e una fotocamera con 2048x2048 7.481; m CCD pixel.
    2. Utilizzare illuminazione uniforme in tutto il campo di vista, che aiuta a riconoscimento di oggetti nella fase soglia di intensità (vedi sotto). A 3 "x3" retroilluminazione funziona bene.
    3. Immagine i vermi su una piastra di supporto posizionata rivolta verso l'alto (coperchio verso il basso), che genera contrasto che si perde quando si usa la retroilluminazione rispetto ad un microscopio tradizionale trasmessa sorgente luminosa.
    4. Preparare il software di analisi di immagine per catturare filmati time-lapse dei vermi in movimento. Impostare il software per catturare le immagini in scala di grigi a 12 bit ogni 1 sec, come 2-min (120 frame) del filmato. Per ridurre la dimensione del file di output, pur mantenendo la risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzare una modalità binning 2x2 per catturare immagini 1024x1024 pixel.
    5. Registrare i film. Iniziare la registrazione di un filmato 120-frame della prima piastra (0 etanolo mM) 10 min dopo gli ultimi vermi sono stati posti su quel piatto. Salvare il file del filmato.
    6. Registrare il secondo piatto (etanolo 400 mm). Ripetere questo processo perentrambi i piatti iniziano 30 minuti dopo le ultime vermi sono stati collocati sul primo piatto (0 etanolo mm) per catturare i 30-32 punti min di tempo per ogni esposizione.
      NOTA: Lasciare il tempo sufficiente per salvare i file di immagine dopo ogni sessione di acquisizione prima di iniziare la registrazione della targa accanto da analizzare.
    7. Per il futuro-proofing di film archiviati e permettere questi film di essere aperti e analizzati da altri programmi software di imaging open source di dominio pubblico, come ImageJ 28, convertire una copia di ogni film a 8-bit 256 file TIFF in scala di grigi.
      NOTA: Il software di analisi delle immagini qui descritto utilizza un formato di file proprietario.
  4. Analisi di filmati utilizzando software ImagePro.
    1. Una volta catturato, analizzare i filmati utilizzando Immagine-Pro Plus software o il suo equivalente.
      NOTA: Una varietà di altri software di monitoraggio oggetto è disponibile che è stato utilizzato per monitorare con successo molteplici C. elegans contemporaneamente 29 e talesoftware potrebbe ragionevolmente sostituire quello descritto qui come le misure di identificazione degli oggetti si basano su principi simili. Il metodo descritto si riferisce alle versioni Immagine-Pro Plus software 6,0-6,3 e 7.0, le versioni più recenti di Immagine-Pro Plus software può avere piccole differenze.
    2. Analizzare i film in 2-min (120 frame) segmenti. Innanzitutto, applicare un filtro alle immagini per appiattire lo sfondo e migliorare il contrasto degli oggetti vermi. Selezionare il filtro come segue: Menu> Processo> Filtri> Miglioramento> appiattire: Parametri: background = scuro; Caratteristica Width = 20 Pix.
    3. Re-salvare i filmati dopo la fase di filtraggio, ma mantenere sempre il film originale nella sua forma non filtrato.
      1. Analizzare la locomozione di animali in ciascun anello separatamente con una regione circolare di interesse (ROI) che è posto e dimensionata per sovrapporsi con l'anello di rame. Identificare e seguire i vermi con il Menu> Misura> Traccia oggetti ... di comando; questo porta il monitoraggio Dfinestra Tabella ata. Il pulsante Opzioni di monitoraggio permette brani specifici da escludere e per limitare eventuali artefatti sperimentali.
    4. Nella scheda Auto Tracking, utilizzare i seguenti parametri: parametri di traccia: il limite di velocità (il raggio di ricerca) = 400 micron / telaio, limite di accelerazione = Auto, Lunghezza minima traccia totale = 400 micron, predominante tipo di movimento = caotico; Oggetti in parametri tracce: Lasciare tracce parziali = yes, lunghezza minima = 21 fotogrammi, Carrellata profondità previsione = 1 fotogramma.
    5. Per avviare il processo di monitoraggio, fare clic sul Trova tutte le canzoni automaticamente tasto di funzione per aprire la finestra di dialogo Count / opzioni di formato e la finestra di dialogo di monitoraggio. Selezionare l'opzione manuale per la Selezione campo di intensità nella finestra di dialogo Conte / dimensione, che fornisce l'importante passo soglia che utilizza l'intensità in scala di grigi del worm pixel per evidenziare un oggetto verme di analisi e di ignorare i precedenti più leggeri pixel.
      1. Regolare la sli soglia intensitàders (uno per impostare il limite superiore, uno per impostare il limite inferiore) per creare un intervallo compreso che mette in evidenza tutti gli oggetti scuri. Una gamma di 0-1,500 su una scala da 0-4,095 è un buon punto di partenza per la sintonizzazione fine.
      2. Applicare un filtro per escludere dimensioni oggetti che sono più grandi e più piccolo di un singolo oggetto senza fine, come l'anello di rame e detriti sulle piastre. Impostare due parametri di dimensione per fare questo che riguardano le dimensioni dei singoli vermi in una varietà di posizioni con la misura> Select Misure voce di menu nella finestra di dialogo Opzioni Count / Taglia. (Range Area: 28,000-120,000 micron 2 e Fascia perimetrale: 600-2,500 micron).
      3. Se un ceppo mutante è significativamente più piccolo o più grande di altri animali sulla piastra da analizzare, ampliare la gamma delle impostazioni di filtro per il riconoscimento di oggetti per accogliere le diverse dimensioni dei ceppi prima di inseguimento animali così che le impostazioni non devono essere modificate mid-analisi.
    6. Completare il processo di monitoraggio facendo clic su Continua nella finestra di dialogo di monitoraggio. Confrontare visivamente le piste di uscita con il progresso di ogni verme nel film per assicurare che ogni worm è rappresentato meno che ci sia un motivo valido per escludere che in base alle impostazioni del filtro automatico. Eliminare manualmente brani che sono stati prodotti dalla presenza di oggetti confermati non vermi che hanno soddisfatto i criteri di filtro dimensioni.
    7. Utilizzare il software per calcolare la velocità di ogni verme tra ogni fotogramma (distanza percorsa per il baricentro di un oggetto per 1 sec tra i fotogrammi) e visualizza la velocità media per ogni traccia e la velocità media di tutte le tracce per la popolazione di vermi in anello di rame. Considerate questo media finale sia n = 1 in termini di prove sperimentali. Esportare i dati in un foglio di calcolo per analisi statistiche e l'archiviazione dei dati.
    8. Una volta che i dati sono stati registrati per il primo anello sulla piastra, spostare la ROI all'anello successivo eripetere il processo di monitoraggio, senza modificare alcun parametro.
    9. Calcola la velocità relativa di locomozione attraverso:
    10. Velocità relativa (%) = trattati (400 mm) Velocità / grezzo (0 mm) Velocità x 100.
      NOTA: diverse manipolazioni genetiche spesso alterano il tasso di locomozione basale di animali. Al fine di determinare l'effetto di etanolo sulla velocità locomozione degli animali e per poter confrontare questi effetti attraverso diversi genotipi o condizioni, calcolare una velocità relativa.

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Risultati

Dati rappresentativi (Figura 1) da diversi genotipi differenti ed i loro controlli appaiati vengono presentati 8,24; i dati sono stati appositamente scelti che le differenze evidenziano negli animali testati. Il grado di effetto a 10 minuti di esposizione è considerata la sensibilità iniziale di un ceppo, che è visualizzata sullo assi sinistra in Figura 1B-G. Ceppi mutanti con una velocità relativa più grande del controllo a 10 min sono considerati resistenti (Figura ...

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Discussione

La semplice neurobiologia e strumenti genetici disponibili in C. elegans rendere il worm un ottimo modello in cui studiare le basi molecolari degli effetti di etanolo sul comportamento. Qui, descriviamo un metodo che è stato utilizzato per individuare alcuni mediatori molecolari ed ambientali della risposta comportamentale acuta etanolo 8,10,20,24,25. Questo metodo consente la differenziazione e l'esame simultaneo di due diversi fenotipi comportamento di risposta etanolo, sensibilità iniziale e l...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni dal National Institutes of Health, Istituto Nazionale per l'alcolismo e abuso di alcool: R01AA016837 (JCB) e P20AA017828 (AGD e JCB).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Linee C. elegansCaenorhabditis Genetics Center
Piatti Petri da 60 x 15 mm, triplo sfogoGreiner Bio-One628161Altre marche di piastre andranno bene.
Agar NGMVarieNaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2,5 g/L), 1 ml di colesterolo (5 mg/ml in etanolo), 1 ml di (1 M) MgSO4, 1 ml di (1 M) CaCl2, 25 ml di (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
ForbiciVariead esempio, Fisher Scientific #10300
Incubatore a 37 °CVariePer asciugare l'agar
Bilancia digitaleVariePer determinare i pesi delle piastre e il volume dell'agar
Anelli di ramePlumbmasterSTK#35583 (48 tappi filettati con guarnizione)Anelli di rame con diametro interno 1,6 cm e diametro esterno 1,8 cm
Etanolo al 100%Varie
Parafilm MBemisPM996
Fotocamera CCDQImagingRET-4000R-F-M-12Questa fotocamera ha un ampio campo visivo.
Stereomicroscopio con C-mount e obiettivo 0,5XLeicaMZ6Modello fuori produzione, l'M60 è l'equivalente attuale.
Fonte luminosaSchottA08923Retroilluminazione 3"x3" per un'illuminazione uniforme su tutto il campo visivo
Software di imaging e trackingMedia CyberneticsImagePro-Plus v6.0-6.3Le versioni più recenti del software hanno funzioni di tracking.

Riferimenti

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