Articolo metodologico

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

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DOI:

10.3791/52685

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17 aprile 2015

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

Abstract

Il sequenziamento di nuova generazione di campioni ambientali può essere impegnativo a causa della quantità e della qualità variabili del DNA in questi campioni. Per ottenere risultati ottimali dal sequenziamento di nuova generazione, sono necessarie librerie di DNA di alta qualità. I campioni ambientali come l'acqua possono avere una bassa qualità e quantità di DNA, nonché contaminanti che co-precipitano con il DNA. I processi meccanici ed enzimatici coinvolti nell'estrazione e nella preparazione della libreria possono danneggiare ulteriormente il DNA. La selezione della dimensione del gel consente la purificazione e il recupero di frammenti di DNA di dimensioni definite per applicazioni di sequenziamento. Tuttavia, questa attività è una delle fasi più dispendiose in termini di tempo nel flusso di lavoro di preparazione della libreria di DNA. Il protocollo qui descritto consente l'automazione completa del caricamento del gel di agarosio, l'analisi elettroforetica e il recupero di frammenti di DNA mirati.

In questo studio, descriviamo un approccio ad alto rendimento per preparare librerie di DNA di alta qualità da campioni di acqua dolce che possono essere applicate anche ad altri campioni ambientali. Abbiamo utilizzato un approccio indiretto per concentrare le cellule batteriche da campioni ambientali di acqua dolce; Il DNA è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio e le librerie di DNA sono state preparate utilizzando un protocollo commerciale basato su trasposoni. Frammenti di DNA da 500 a 800 bp sono stati selezionati utilizzando la tecnologia Ranger, una stazione di lavoro automatizzata per elettroforesi. Il sequenziamento delle librerie di DNA selezionate per dimensioni ha dimostrato miglioramenti significativi nella lunghezza di lettura e nella qualità delle letture di sequenziamento.

Introduzione

La metagenomica prevede il sequenziamento di tutto il materiale genetico in un campione per caratterizzare le comunità microbiche presenti. Si tratta di un processo complesso e costoso che prevede la conversione degli acidi nucleici estratti in librerie di DNA, seguita dal sequenziamento di nuova generazione. Le librerie di alta qualità sono essenziali per massimizzare l'output dei dati e un'analisi metagenomica accurata. I campioni ambientali, come i campioni d'acqua, spesso pongono sfide significative alla generazione di librerie di alta qualità, a causa delle basse quantità di DNA che possono anche essere degradate1-3 e della presenza di inibitori della PCR4-6.

Le librerie di alta qualità sono idealmente costituite da segmenti più lunghi di DNA all'interno di una gamma ristretta di lunghezze. Al fine di massimizzare la quantità di dati utili generati per ogni ciclo di sequenziamento, la lunghezza del DNA nella libreria dovrebbe essere almeno pari alla lunghezza massima di lettura del metodo di sequenziamento utilizzato. Quando si utilizza una tecnologia di sequenziamento per sintesi come l'Illumina MiSeq, la dimensione dei frammenti di DNA influisce sull'efficienza con cui i cluster vengono generati sulla cella di flusso. Ad esempio, quando una libreria contiene frammenti di DNA sia più corti che più lunghi, quelli più corti saranno sovrarappresentati nei dati di sequenziamento7,8. Al contrario, una libreria con frammenti di DNA di dimensioni simili sarà rappresentata proporzionalmente nei dati di sequenziamento. Molti kit di preparazione delle librerie utilizzano metodi basati sulla legatura per aggiungere adattatori ai frammenti di DNA e la selezione delle dimensioni è necessaria per rimuovere i dimeri adattatori che non contengono un inserto9,10. Esistono numerosi metodi11,12 per raggiungere questo obiettivo, ma l'unica tecnica che fornisce i risultati più coerenti è la separazione elettroforetica del DNA seguita dal recupero delle lunghezze desiderate di DNA13,14. Questo processo può essere eseguito manualmente per un numero ridotto di campioni, ma quando si tratta di elaborare centinaia di campioni, sono necessarie soluzioni automatizzate. Le piattaforme attualmente disponibili per la selezione automatizzata delle dimensioni dei gel sono a bassa produttività e sono necessarie nuove piattaforme per elaborare un gran numero di campioni per il sequenziamento. La tecnologia Ranger può essere integrata con le stazioni di lavoro esistenti per la manipolazione dei liquidi per consentire l'uso dell'elettroforesi su gel di agarosio per la selezione delle dimensioni e per scopi analitici su una scala che soddisfa l'ambiente odierno ad alta produttività.

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Protocollo

1. Raccolta Acqua e Filtrazione

  1. Raccogliere campioni di acqua dolce provenienti da vari siti (Figura 1). Passare campioni attraverso una serie di filtri: 1 micron filtro, filtro 0,2 micron, e 30 kDa taglio del filtro a flusso tangenziale sistematicamente eucariotica separata, particelle di dimensioni batteriche e virali, rispettivamente.
    Nota: Solo la purificazione e analisi del materiale recuperato sui 0,2 micron filtri (batteri a vita libera) è descritta in questa relazione, ma approcci simili possono essere utilizzati per le altre particelle recuperate dai filtri.

2. Concentrazione batterica, estrazione e purificazione del DNA

  1. Rimuovere il filtro a membrana 0,2 micron (s) dal sistema di filtrazione dell'acqua (diagramma schematico, Figura 2). Piegare il filtro 0,2 micron disco a metà e posizionarlo in un tubo da 50 ml con il lato aperto in alto. Aggiungere 5 ml di soluzione tampone fosfato 1x (PBS) e 0,01% Tween, pH 7.4 inil tubo. Se più di un filtro viene utilizzato durante il processo di impiegare un tubo diverso per filtro. Tubo negozio (s) con filtro a 4 ° C fino elaborato. In caso contrario, passare al punto 2.2.
  2. Rimuovere il filtro 0,2 micron membrana dal tubo 50 ml con una pinza sterile. Filtro Place (s) su una piastra di Petri (lasciare il tampone PBS nel tubo).
    1. Con pinze sterili e forbici sterili, tagliate il filtro in piccole strisce (1 cm x 1 cm). Disinfettare pinze e forbici immergendo nel 70% isopropanolo, asciugandosi con un DNA di superficie decontaminante e risciacquo con acqua ultrapura di tipo 1 tra i diversi campioni.
  3. Posizionare il filtro tagliato a striscioline di nuovo nello stesso tubo da 50 ml. Aggiungere 10 ml di PBS 1x e 0,01% Tween, pH 7.4 al filtro quindi c'è un totale di 15 ml di tampone nella provetta 50 ml.
  4. Aggiungere 6 perle di tungsteno pulite (3 mm di diametro) in ciascun tubo 50 ml, coprire il tubo con Parafilm, e vortex energicamente per 20 minuti (utilizzare 50 ml tubi adattatore vortex). Se multiple filtri vengono elaborati da un campione, trasferimento e piscina tutto l'omogeneizzato in una provetta pulita 50 ml. Centrifugare le provette a 3.300 xg per 15 min a 4 ° C.
  5. Risospendere il pellet e aliquote cellule batteriche (~ 1 ml Aliquote) in 1,7 ml microprovette. Si noti che ci saranno 5 provette da microcentrifuga per campione.
  6. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 10.000 xg per 10 min, e rimuovere la maggior parte del surnatante fino a ~ 200 microlitri mark.
  7. Conservare i campioni a -80 ° C, o procedi per estrarre DNA batterico utilizzando un kit di isolamento di DNA disponibile in commercio come da istruzioni del produttore. Durante l'uso batterica estrazione del DNA sia PBS o acqua come controllo di estrazione negativo e E. coli come controllo di estrazione positivo.
  8. Poiché DNA da più tubi vengono estratti, piscina sub-aliquote parallele dello stesso campione in una provetta 2 ml. Poi condurre / N precipitazione O utilizzando una soluzione composta da 0,1volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo al 100%, e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene e conservare i campioni a -80 ° C.
  9. Centrifugare alla massima velocità (17.000 xg) per 30 minuti a 4 ° C. Lavare pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%, aria secca in un armadio biosicurezza per non più di 5 min e risospendere pellet di DNA in 34 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Nota: acrilamide lineare aiuterà a visualizzare pellet di DNA dopo la O / N precipitazione.
  10. Determinare la quantità di DNA e di qualità utilizzando una sensibilità elevata fluorescenza nucleico test acido quantificazione e uno spettrofotometro microvolumi, rispettivamente, seguendo le istruzioni del fabbricante (vedi tabella dei Materiali).
    Nota: Se più campioni vengono preparati al momento, una fluorescenza test acido nucleico ultrasensibile per quantificare dsDNA e basata su piastra fluorimetro / spettrofotometro può essere usato al posto.

3. DNA Biblioteca Preparazione

  1. Normalizza DNA batterico genomico estratto da campioni di acqua ad una concentrazione di ~ 0,2 ng / ml.
  2. Enzimaticamente frammento uno nanogrammi di DNA batterico utilizzando un metodo basato trasposone-(tagmentation). Aggiungere adattatore e index sequenze sul DNA frammentato seguendo le istruzioni del produttore. Soggetto tagmented campioni a 12 cicli di PCR, come indicato nelle istruzioni del produttore, a quel punto gli indici di sequenziamento sono incorporati.

4. Automated Gel Selezione Size

  1. Salta standard di post-PCR clean-up step descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Tabella dei Materiali). Formato selezionare campioni post-PCR direttamente utilizzando una piattaforma automatizzata di selezione del formato a base di gel.
    1. Aggiungere 3,5 ml di tampone di caricamento per ogni campione.
    2. Dopo il protocollo del produttore, caricare i campioni alla workstation elettroforesi, specificando un target formato-selezione di 500-800 bp, in un estratto di 300 mlvolume di ioni, con un 1,5% di agarosio cassette pre-cast.
    3. Concentrare il materiale in uscita prima (300 ml), fino a 25 ml di etanolo tramite precipitazione.
      Nota: In alternativa, utilizzare la workstation elettroforesi per automatizzare la concentrazione per un maggior numero di campioni tramite piastra di filtraggio e del collettore di aspirazione.
      1. Precipitare il volume di eluizione grezzo utilizzando 0,1 volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo 100% e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene, posto i campioni a -80 ° CO / N. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 30 min.
      2. Eliminare surnatanti e procedere a lavare pellet di DNA con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%.
      3. Centrifugare i campioni di nuovo a 17.000 xg per 30 min, scartano surnatanti, aria secca, e infine risospendere pellet di DNA in 25 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Opzionale) Utilizzare 1 ml di dimensioni librerie DNA selezionato con la piattaforma di selezione formato gel automatico per fare un cinquediluizione -fold con soluzione tampone Tris-EDTA, pH 8.0. Analizzare le librerie con uno strumento elettroforesi capillare basato su chip per analizzare dsDNA qualità secondo le istruzioni del produttore.

5. Biblioteca Normalizzazione e Sequencing

  1. Procedere per normalizzare i campioni utilizzando perline di normalizzazione della biblioteca (inclusi nel kit di preparazione biblioteca basato transposon-) come descritto nella guida di preparazione del produttore.
    1. In alternativa, misura librerie dsDNA usando un'alta sensibilità fluorescente nucleico dosaggio acido quantificazione, seguita riunendo a rapporti equimolari per raggiungere una concentrazione finale di dsDNA 2 nM. Procedere a denaturare librerie utilizzando 10 ml di biblioteche in pool e 10 ml di 0,2 N NaOH, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Diluire librerie denaturati mediante tampone di ibridazione (incluso con il kit di preparazione a base transposon-) per un volume finale di 1 ml e la concentrazione di 11:05.
  2. Caricare il campiones in una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione seguendo i protocolli standard di sequenziamento del produttore.

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Risultati

Concentrazione DNA, e valutazione della qualità

Concentrazioni DNA batterico variava ,01-0,11 ng ​​/ ml per campione dei vari siti di bacino (Tabella 1). DNA isolato da frazione batterica aveva A 260/280 e 260/230 A rapporti di 1,4-1,8 e 0,3-1,6 rispettivamente. Mentre alcuni dei coefficienti A 260/230 erano relativamente bassa, nessuna inibizione apparente è stata osservata nella biblioteca preparato e altre applicazioni a v...

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Discussione

La presenza di dimeri adattatori e raggruppamento di piccole dimensioni inserto preferenzialmente essere sequenziati in piattaforme attuali rappresentano una diminuzione delle rese utilizzabili e sotto-utilizzo della capacità di 15 dell'apparecchiatura. L'uso di metodi branello battitori combinati con un approccio basato trasposone-per preparare librerie può comportare più di taglio DNA rispetto ad altri metodi di estrazione 4,5. Tuttavia, tutti i metodi di estrazione e biblioteca preparazi...

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Dichiarazioni

Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt entrambi titolari di azioni di Coastal Genomics, una società di proprietà privata British Columbia offre la tecnologia Ranger.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da Genome BC, Genome Canada e Coastal Genomics. Gli autori ringraziano Kirby Cronin e Michael Chan per il loro aiuto nella raccolta e nell'elaborazione dei campioni. Vorremmo anche ringraziare Thea Van Rossum e la dottoressa Fiona Brinkman per l'assistenza bioinformatica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pompa peristaltica Masterflex P/S Serie 1400Thermo Scientific 1400-1620
0,2 & micro; m Supor MembranaVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Perline in carburo di tungsteno 3 mm (200)Qiagen69997
Alcool isopropilico 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Sistema di purificazione dell'acqua Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Questo sistema è stato interrotto.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Adattatore Vortex per 2 (50  ml) tubiVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (Modello G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Beckman CentrifugaRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModello J-6B
PowerLyzer Powersoil Kit di isolamento del DNAVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Adattatore Vortex per 24 provette (1,5-2 ml)VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Centrifuga Microfuge 18Beckman Coulter367160
Nimbus Seleziona workstation con Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Include la stazione di lavoro per la manipolazione dei liquidi e il kit di reagenti Ranger Tech (hardware per elettroforesi)
Coastal GenomicsCG-10600-150-12-21Include tampone di caricamento e cassette Alcool
etilico (anidro)Alcoli commercialiP016EAANGreenfield Etanolo
Acetato di sodioSigma-AldrichS2889-250G
Acrilammide lineare (5  mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf centrifuga refrigerataRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Tampone EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 SpettrofotometroThermo ScientificND-1000
Qubitfluorimetro Life TechnologiesQ32857Invitrogen. Questo prodotto è fuori produzione.
Kit di analisi Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Reagente DNA ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-4626
Chip DNA ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-4626
Bioanalizzatore Agilent 2011Agilent TechnologiesNextera
XTIlluminaFC-131-1024
Kit di indice Nextera XTIlluminaFC-131-1001
Kit di reagenti MiSeq v2 (500 cicli)IlluminaMS-102-2003
Sistema MiseqIlluminaSY-410-1003
integrato Kit di preparazione del campione di DNA

Riferimenti

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