Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un'adesione test in vitro con cellule tumorali.
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Articolo metodologico
Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Neutrofili extracellulari Traps (NET) sono stati recentemente identificati come parte dell'armamentario antimicrobica del neutrofili. Oltre al loro ruolo nella lotta contro le infezioni, una recente ricerca ha dimostrato che possono essere coinvolti in molti altri processi patologici, tra cui la progressione del cancro. Isolare NET purificati è un elemento cruciale per consentire lo studio di queste funzioni.
In questo video, dimostriamo un metodo semplificato di cella di isolamento NET esenti da sangue umano intero utilizzando reagenti prontamente disponibili. Isolati NET possono poi essere utilizzati per immunofluorescenza, cancellando o vari test funzionali. Ciò consente una valutazione delle loro proprietà biologiche in assenza dei potenziali effetti confondenti di neutrofili stessi.
Una tecnica di separazione gradiente di densità viene impiegato per isolare neutrofili dal donatore sano sangue intero. Isolati neutrofili sono poi stimolati da phorbol 12 MYRiState 13-acetato (PMA) per indurre NETosis. Neutrofili attivati vengono poi scartati, e uno stock NET cell-free si ottiene.
Abbiamo poi dimostra come NET isolato può essere utilizzato in un test di adesione sulle cellule tumorali del polmone A549 umani. Lo stock NET è usato per rivestire i pozzi di un 96 e piastra di coltura cellulare O / N, e dopo aver assicurato una adeguata formazione monostrato NET sul fondo dei pozzetti, CFSE etichettati cellule A549 sono aggiunti. Cellule aderenti sono quantificati tramite un microscopio a fluorescenza Nikon TE300. In alcuni pozzi, 1000U DNAse1 viene aggiunto 10 minuti prima di contare fino a degradare NET
Introduzione
Neutrofili trappole extracellulari (NET) sono state recentemente scoperti elementi neutrofili-derivati composti da filamenti di DNA extracellulare decorate da centinaia di proteine e istoni. Essi sono secreti dai neutrofili nel contesto di infezione e infiammazione seguenti stimoli specifici e la loro iscrizione iniziale di far parte dei meccanismi del neutrofili di difesa contro le infezioni. Sono stati mostrati prima a promuovere la cattura di vari invasori microbici compresi batteri, virus e funghi 1-3. Trapping del microbo potrebbe poi portare alla sua distruzione sia direttamente da proteine NET-associate 3,4 e indirettamente, attrave....
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Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida etiche istituzionali locali.
Disegno 1. Sangue
- Attraverso venipucture antecubitale, raccogliere 14 provette di sangue da un volontario sano in top verde (eparina) tubi e capovolgere ogni tubo prima di stabilirsi sul ghiaccio. Prelevare il sangue entro 10 - 15 minuti di esperimento per garantire la resa ottimale dei neutrofili.
2. neutrofili Isolamento da sangue intero
- Lavare ciascun tubo verde superiore di sangue con 5 ml di PBS senza Ca e Mg per diluire il sangue. In ognuno dei 4 x 50 ml conici, aggiunge....
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Risultati
Conseguimento di successo di un saggio di adesione statica con NET richiede adeguata rivestimento dei pozzetti con un monostrato di NET prima dell'aggiunta di cellule tumorali (Figura 1). Tutte le fasi successive devono essere eseguiti con attenzione a non interrompere quel livello. Quando si forma un adeguato strato di NET, si prevede una consistente cellule tumorali adesione NET come si vede nella Figura 2A e 2C. Questo effetto è abolita con l'aggiunta di DNAs.......
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Discussione
Il protocollo di isolamento trappola neutrofili extracellulare dimostrato in questo video combina diverse tecniche utilizzate in letteratura per l'isolamento dei neutrofili e la formazione NET. Semplifica un processo abbastanza complesso e variabile e offre un modo molto affidabile e replicabile per isolare NET privi di cellule purificate con meno passaggi rispetto ad altri protocolli. Inoltre, i reagenti immediatamente disponibili sono impiegati aggiungendo al protocolli semplicità e riducendo in modo significativo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Kubes per la sua guida e il suo mentoring che sono stati fondamentali nella costruzione di questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), modificata, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio | Wisent | 311-425-CL | |
| Terreno di separazione dei linfociti (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Destrano cloridrato (polvere) | Spettro | DE130 | La soluzione di destrano al 6% è prodotta integrando PBS con Ca e Mg con polvere di destrano al 6% |
| RPMI-1640 Medium con L-glutammina | Wisent | La soluzione 350-000-CL | al 3% di RPMI è prodotta integrando l'RPMI con il 3% di siero fetale bovino |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Piatto di coltura tissutale integride con griglia da 20 mm (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
Riferimenti
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
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Ristampe e permessi
