Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule endoteliali linfatiche rivestono i vasi cisti-come malformazione linfatica umani e prepuzi utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Coltura delle cellule e successiva espansione di queste cellule permette un nuovo livello di sofisticazione sperimentale per studi genetici, proteomica, funzionali e differenziazione cellulare.

Abstract

Disturbi del sistema linfatico, come linfedema primario, malformazioni linfatiche e tumori linfatici sono condizioni rare che causano una significativa morbidità, ma poco si sa sulla loro biologia. Isolando cellule altamente puri umane endoteliali linfatiche (LECs) dal tessuto malato e sano faciliterebbe studi dell'endotelio linfatico a livello genetico, molecolare e cellulare. Si prevede che queste indagini possono rivelare bersagli per nuove terapie che possono cambiare la gestione clinica di queste condizioni. Un protocollo che descrive l'isolamento di umana prepuzio LEC e malformazioni linfatiche linfatici cellule endoteliali (LM LECs) è presentato. Per ottenere un unico tessuto sospensione cellulare è stata tritata e enzimaticamente trattati con dispasi II e collagenasi II. La sospensione risultante singola cellula fu poi etichettata con anticorpi anti-cluster di differenziazione (CD) marker CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) e PODOPLANIN. Staicellule vitali ned state ordinate su un cell sorter fluorescente attivate (FACS) per separare la popolazione CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos LM LEC da altre cellule endoteliali e non endoteliali. I LM LEC ordinati erano colti e ampliato su palloni fibronectina rivestite per uso ulteriore sperimentale.

Introduction

Una delle principali funzioni del sistema vascolare linfatico è di assorbire la linfa, un fluido interstiziale eccesso contenente lipidi, proteine ​​e componenti cellulari, e condurre al sistema venoso del sangue. Una rete di capillari linfatici dirige linfa ai linfonodi dove viene proiettato per la presenza di antigeni estranei, un processo importante nella sorveglianza e la diffusione delle cellule bianche del sangue per neutralizzare antigeni estranei immunitario.

Il sistema linfatico unidirezionale inizia nei tessuti con capillare linfatica iniziale, una struttura unica con un singolo strato discontinuo di cellule endoteliali piatte a....

Protocol

Etica dichiarazione: approvazione etica per la raccolta di malformazione e prepuzio tessuti linfatici sono state ottenute dai Comitati Etici di Ricerca Umane presso l'ospedale pediatrico di Reale, Melbourne, Australia. Firmato accordo è stato ricevuto dai genitori dei pazienti prima di un intervento chirurgico. I campioni di tessuto sono stati prelevati da pazienti con diagnosi di LM sottoposti a procedure chirurgiche come parte della loro gestione clinica e pazienti sottoposti a circoncisione elettivo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Health and Medical Research Council, Australia.

....

Results

Dopo la digestione del tessuto iniziale, dopo 24 ore di coltura di campioni non frazionate, distinte colonie di cellule endoteliali può essere osservato (Figura 2A) unitamente a cellule fibroblasto-simili e le cellule muscolari lisce. A seguito di selezione e dopo 24 ore di coltura cellulare, le CD34 ^Bassa CD31 ^Pos VEGFR-3 celle ^Pos Podoplanin ^Pos attaccare e mostra morfologia tipica di ciottoli (Figura 2B e C). Utilizzando il.......

Discussion

LEC svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi fluido, risposta immunitaria agli antigeni estranei e l'assorbimento e il trasporto di alcuni nutrienti. Omeostasi LEC può essere influenzata da processi di malattia, come le infezioni batteriche e metastasi tumorali, ma LEC può anche sviluppare mutazioni somatiche che provocano la formazione di vasi linfatici disfunzionali e una significativa morbidità nei pazienti affetti. Per ottenere una maggiore comprensione di linfatica malformazione eziologi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Utilizzato per raccogliere campioni di tessuto dalla sala operatoria.
Kit proiettili EGM-2 MV	Lonza	CC-3202	Il kit proiettile EGM-2 MV contiene 500 ml di terreno EBM-2 e EGF umano, idrocortisone, gentamicina (GA-1000), siero fetale bovino (FBS), VEGF, FGF-b umano, R3-IGF-1 e acido ascorbico.
VEGF-C	R& D Systems	2179-VC-025	terreno cellulare endoteliale completo è integrato con 50 ng/ml di soluzione
antibiotico-antimicotica VEGF-C (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	Questa soluzione contiene 10.000  U/ml di penicillina, 10.000  mg/ml di streptomicina e 25  mg/ml di antimicotico Fungizone. Utilizzare in diluizione 1:100.
Fibronectina dal plasma umano	Sigma-Aldrich	F2006	Usato a concentrazioni di 10 mg/ml. Può essere riutilizzato fino a 1 mese se mantenuto a 4  ° C e mantenuto sterile. Usa 7  ml per rivestire 150 cm2 pallone.
StemPro Accutase Reagente per dissociazione cellulare	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro® Accutase® viene utilizzato a 0,05 ml per cm2 per coprire l'intera superficie del pallone. L'uso di volumi inferiori può causare un distacco incompleto delle cellule.
0,4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Utilizzato come colorante di vitalità.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Utilizzato allo 0,04%
Collagenasi II	Worthington Lab	4176	Utilizzato allo 0,25%
DNasi I	Roche Applied Biosciences		11284932001 Utilizzato allo 0,01%
Filtri cellulari in nylon da 70 mm	BD Falcon	352350
[header]
Clone VEGFR-3 coniugato PE 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Utilizzato a diluizione 1:50
PE-Cy7-CD34 coniugato, clone 581	BioLegend	343516	Utilizzato a diluizione 1:200
Topo coniugato APC anti umano CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Utilizzato a diluizione 1:100
Alexa 488-coniugato ratto anti podoplanina umana, clone NC-80.	BioLegend	337006	Utilizzato a diluizione 1:200
PE-consorte IgG1 di topo, isotipo k, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Utilizzato a diluizione 1:50
PE-Cy7-IgG1 di topo coniugato, isotipo k, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Utilizzato a diluizione 1:200
IgG1 di topo coniugato con APC, isotipo k, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Utilizzato a diluizione
1:100IgG2a di topo coniugato Alexa 488, isotipo k, clone RATK2758	BioLegend	400525	Utilizzato con diluizione 1:200