Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Sommario

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Abstract

L'incidenza di adenocarcinoma esofageo e il suo precursore, metaplasia di Barrett, sono in rapido aumento nel mondo occidentale. Inoltre adenocarcinoma esofageo ha in genere una prognosi infausta, con scarso miglioramento dei tassi di sopravvivenza negli ultimi anni. Queste sono condizioni difficili da studiare e vi è stata una mancanza di piattaforme sperimentali adatti per indagare i disturbi della mucosa esofagea.

Un modello della mucosa esofagea umano è stato sviluppato in laboratorio MacNeil che, a differenza dei sistemi di coltura cellulare 2D convenzionali, ricapitola le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice presenti in vivo e produce un maturo, epitelio stratificato simile a quello della normale umana esofago. In breve, il modello si usano cellule non trasformate normali primari fibroblasti umani esofagee e epiteliali coltivate all'interno di un ponteggio acellulare esofageo suina di derivazione. Caratterizzazione immunoistochimica di questo modelloda CK4, CK14, Ki67 e involucrina colorazione dimostra adeguata ripresa del istologico della mucosa esofagea umano.

Questo modello fornisce un robusto, modello sperimentale biologicamente rilevanti della mucosa esofagea umana. Può essere facilmente manipolato per indagare su una serie di domande di ricerca, tra cui l'efficacia di agenti farmacologici e l'impatto dell'esposizione a fattori ambientali, come l'alcool, le tossine, ad alta temperatura o componenti refluito gastro-esofageo. Il modello facilita anche periodi prolungati di coltura non ottenibili con coltura cellulare convenzionale 2D, consentendo, tra l'altro, lo studio dell'impatto di esposizione ripetuta di un epitelio maturo per l'agente di interessi per un massimo di 20 giorni. Inoltre, una varietà di linee cellulari, come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett, può essere incorporata nel modello per studiare processi come invasione tumorale e responsivene drogass in un ambiente più biologicamente rilevante.

Introduzione

La mucosa esofagea comprende una stratificato, epitelio squamoso sopra uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria, ed è uno dei primi siti per incontrare stress ambientali ingeriti. L'esposizione a tossine alimentari è implicato nello sviluppo del carcinoma squamoso dell'esofago, mentre reflusso duodenogastro-esofageo è un fattore critico nella patogenesi della Barrett Metaplasia, che è associata ad un aumentato rischio di progressione di adenocarcinoma esofageo. Carcinomi esofagei sono l'8 ^° più comune tumore maligno nei maschi del Regno Unito e di adenocarcinoma esofageo è in rapido aumento nel mondo occidentale ^1. Inoltre....

Protocollo

Cellule esofagee umane sono ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Il consenso informato è ottenuto per il tessuto da utilizzare a scopo di ricerca, e il tessuto utilizzato in modo anonimo sotto le opportune approvazioni etiche (SSREC 165/03, Tessuto umano di ricerca Bank Licenza 12179).

1. Isolamento di cellule umane esofageo epiteliali

1. Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, preparare il terreno di coltura epiteliale mescolando medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) e F12 di Ham in un rapporto 3: 1 (v: v). Aggiungere 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml fattore di crescita epidermico, 0,4 mg ....

Risultati

Questo manoscritto descrive il processo necessario, indicata schematicamente in figura 1, alla cultura modelli 3D dell'epitelio esofageo umana con successo. Per confermare l'idoneità del modello come una piattaforma sperimentale istologico e gli studi di immunoistochimica sono stati intrapresi confrontando i tessuti coltivati ​​con mucosa esofagea squamose umano.

Valutazione istologica dell'epitelio prodotto con il metodo descritto mostra un maturo, multistrato, .......

Discussione

Questo manoscritto descrive la produzione e caratterizzazione di un modello mucosa esofagea umana biologicamente rilevante adatto per l'uso come una piattaforma sperimentale per studiare l'impatto dell'esposizione a fattori di stress ambientali sulla dell'epitelio esofageo.

I passi più critici per la produzione di successo di un modello mucosa esofagea umano sono: garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali rimangono proliferativa e non hanno già cominciato a diff.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tripsina	BD Biosciences	215240	Preparare una soluzione allo 0,1% p/v in PBS e filtrare sterilizzare. Caldo in 37  ° C bagnomaria prima dell'uso.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Caldo in 37  ° C bagnomaria prima
dell'uso Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37  ° C bagnomaria prima dell'uso
Siero di vitello fetale	Labtech	FB-1090
Fattore di crescita epidermico Sistemi	R+D	236-EG-200	Preparare 200 &; g/ml di soluzione madre in 10 mM di acido acetico, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Preparare la soluzione madre in PBS e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	Preparare la soluzione madre in PBS e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Insulina	Sigma-Aldrich	I2767	Preparare 10 mg/ml di soluzione in 0,01  M HCl, diluire 1:10 in acqua distillata e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Transferrina	Sigma-Aldrich	T2036	Preparare la soluzione madre in acqua distillata e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Triiodotironina	Sigma-Aldrich	T2752	Preparare la soluzione madre in acqua distillata e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Tossina del colera	Sigma-Aldrich	C8052	Preparare la soluzione madre in acqua
L-Glutammina	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P0781
Amfotericina B	Gibco	15290-026	Marca Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Sciogliere 1 compressa in 100  ml di acqua e autoclave per sterilizzare
Collagenasi A	Roche	10103578001
Soluzione di iodio povidone	Ecolab	10830E	Marca Videne
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Siero di vitello neonato	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Preparare la soluzione madre in DMEM e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Etanolammina	Sigma-Aldrich	E9508	Preparare la soluzione madre in DMEM e filtrare sterilizzare prima dell'uso
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Preparare la soluzione madre in DMEM e filtrare sterilizzare prima dell'uso use
O-fosforiletanolammina	Sigma-Aldrich	P0503	Preparare la soluzione madre in DMEM e filtrare sterilizzare prima dell'uso
ITS (insulina, transferrina, selenio)	Lonza	17-838Z	Utilizzato per la preparazione di terreni compositi
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Caldo in 37  ° C bagnomaria prima dell'uso
EDTA 0,02% soluzione	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37  ° C bagnomaria prima dell'uso
Pallone di coltura T75	VWR	734-2313
provetta da centrifuga da 50 ml	Fisher	11819650
provetta universale da 15 ml	SLS	SLS7504
vaso da 180 ml	VWR	216-2603
piastra di Petri	SLS	150350
piastra a 6 pozzetti	VWR	734-2323
anelli			Prodotto in casa - acciaio inox per uso medico, diametro interno 10 mm, diametro esterno 20 mm
		rete d'acciaio	Prodotto in casa - le lamiere hanno fori di 0,3 cm di diametro, piegate per produrre una griglia 2  cm (L) x 2 cm (P) x 0,5 cm (A)
KI67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1. Utilizzare a 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10. Utilizzare a 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002. Utilizzare a 1:200.
Involucrina	Novocastra	INV	Clone SY5. Utilizzare a 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Fibroblasti 3T3 di topo	ATCC-LGC	CRL-1658	precedentemente arrestati dalla crescita mediante irradiazione (60 Gy)

in acciaio inox griglie in