Le cellule staminali mesenchimali sono solitamente ottenute dal midollo osseo e richiedono una coltura di espansione. Quando i campioni coagulano prima dell'elaborazione, è possibile applicare un protocollo che utilizza il farmaco trombolitico (enzimatico) urochinasi per degradare il coagulo. In questo modo, le cellule vengono rilasciate e disponibili per la coltura di espansione. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento.
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Articolo metodologico
Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) - solitamente ottenute dal midollo osseo - richiedono spesso una coltura di espansione. Il nostro protocollo utilizza l'urochinasi di grado clinico per degradare i coaguli nel midollo osseo e rilasciare MSC per un ulteriore utilizzo. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento del midollo osseo. Il midollo osseo è una delle principali fonti di MSC, che sono interessanti per l'ingegneria tissutale e le terapie con cellule staminali autologhe. Dopo la sospensione, il midollo osseo può coagulare, poiché comprende tutto il sistema ematopoietico. I coaguli risultanti contengono anche MSC che vengono perse per la coltura di espansione o la terapia diretta con cellule staminali. Abbiamo sperimentato che il 74% dei campioni di midollo osseo canino conteneva coaguli e produceva meno della metà del numero di cellule staminali previsto dai campioni non coagulati. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per la digestione enzimatica di quei coaguli per evitare il ricampionamento del midollo osseo intenso e costoso. L'urochinasi, un farmaco trombolitico clinicamente approvato e prontamente disponibile, elimina quasi completamente i coaguli del midollo osseo. Di conseguenza, gli aspirati di midollo osseo trattati producono un numero di MSC simile a quello dei campioni non coagulati. Inoltre, dopo il trattamento con urochinasi, le cellule hanno mantenuto la loro attività metabolica e la capacità di differenziarsi in linee condrogeniche, osteogeniche e adipogeniche. Il nostro protocollo recupera campioni di sangue coagulato e midollo osseo senza compromettere la qualità delle cellule. Questo ricampionamento obsoleto, riduce notevolmente i costi di campionamento e consente l'uso di campioni coagulati per la ricerca o la terapia.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule 1 e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe 2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati 4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate 5.
La cresta iliaca permette di raccogliere una notevole quantità di midollo osseo e serve quindi come sito principale di aspirazione 6. Tuttavia, la qualità del aspirato diminuisce con l'aumento del volume di midollo osseo prelevato. Mentre i primi 5 ml di midollo osseo contengono cellule staminali mesenchimali di alta qualità, ritiro delle maggiori volumi porta alla diluizione del aspirato con sangue periferico fROM l'osso altamente vascolarizzato 7. A causa delle attuali megacariociti e piastrine, aspirati di midollo osseo sono inclini a coagulazione, a meno di utilizzare anticoagulanti. Ma anche con anticoagulanti, possono verificarsi la formazione di coaguli.
Nel midollo osseo, cellule staminali mesenchimali rappresentano solo una piccola parte del pool di cellule totale 8 e devono essere espansa in coltura per più ingegneria dei tessuti o applicazioni terapeutiche 4. La qualità di una tale cultura dipende in gran parte la piscina cellula iniziale, vale a dire., La diversità e un alto numero di partenza 9. Basso numero di cellule staminali mesenchimali da prelievi possono essere in parte spiegati dalla variabilità dei donatori. D'altra parte, MSC da campioni bassa qualità richiedono tempo maggiore di cultura e passaging esteso a raggiungere il numero desiderato di celle. In entrambi i casi, passaging esteso è fonte di senescenza cellulare e può portare alla perdita di differenziazione potenziale 10. Pertanto, i protocolli in grado di massimizzare cellulare y ottimizzatoield ed evitare effetti nocivi devono essere sviluppati 11,12.
Quando abbiamo cominciato a lavorare con MSC canina, siamo stati sorpresi di vedere che circa tre su quattro campioni di midollo osseo canini contenuti coaguli, mentre i campioni umani fortunatamente coagulato (uno su dieci) erano meno frequenti. D'altra parte è stata una sorpresa, che abbiamo osservato rendimenti molto più bassi di cellule staminali mesenchimali da campioni coagulati. Per risolvere il problema ricorrente dei campioni coagulati, abbiamo sviluppato il protocollo con il urokinase droga trombolitico invece di ricampionamento.
Terapie trombolitici possono contrastare in pericolo di vita situazioni come l'occlusione dei vasi sanguigni, causando un attacco di cuore, ictus o embolie a causa di coagulazione indesiderati. Funzionano degradazione dei coaguli attraverso taglio enzimatico di fibrina da plasmina e del plasminogeno attivatori enzimatici. Nonostante l'ampio uso per il trattamento di pazienti, solo pochissime pubblicazioni esistono che le attività trombolitici utilizzate, c'eper applicazioni di laboratorio per salvare campioni coagulati, soprattutto concentrandosi su linfociti. Nel 1987, Niku et al. descritto l'uso di streptochinasi per dissolvere i coaguli di sangue con conseguente linfociti funzionali 13 e quattro anni dopo, De Vis et al. esteso l'uso di streptochinasi per isolare cellule leucemiche dal sangue e del midollo osseo per le applicazioni di citometria a flusso 14. Una pubblicazione più recente suggerisce l'uso di Alteplase per la diagnostica del cancro 15. Mentre si utilizza lo stesso approccio enzimatico, il nostro protocollo si concentra su l'isolamento di cellule staminali mesenchimali multipotenti forma di midollo osseo per fornire uno strumento per i ricercatori nel campo delle cellule staminali.
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Protocollo
NOTA: aspirati di midollo osseo umano dalla cresta iliaca sono stati raccolti da donatori consenzienti, con l'approvazione del comitato etico del cantone di Lucerna. Canine aspirati di midollo osseo da cresta iliaca sono stati raccolti con consent.Human del proprietario del cane (circa. 20 ml) e canino (circa. 10 ml) aspirati di midollo osseo erano anti-coagulato per aggiunta di 15 ml di 3,8% di citrato di sodio immediatamente dopo la sospensione in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti al ambiente di laboratorio per la lavorazione lo stesso giorno ritirata.
1. Preparazione di Urokinase (Prima del 1 ° Use)
- Ricostituire urokinase utilizzando sterile tampone fosfato salino (PBS) secondo le istruzioni del produttore: Aggiungere 10 ml di PBS al pallone setto-ingresso utilizzando una siringa da 10 ml. Sciogliere la sostanza secca agitando per ottenere 50.000 unità di iniezione (U) per ml.
- Preparare 500 microlitri aliquote (25.000 U ciascuno) in stubi terile. Conservare aliquote -20 ° C e utilizzare quando richiesto per almeno 6 mesi.
2. preparative Steps (prima di ogni midollo osseo Treatment)
- Scongelare una aliquota di urochinasi (25.000 U) per coagulato aspirato midollare (volumi di aspirato fino a 25 ml sono stati trattati con successo con una sola aliquota di 25.000 U).
- Preriscaldare un bagno d'acqua o agitazione incubatore a 37 ° C.
3. enzimatica Digest del Clot
- Eseguire tutti i lavori in una cappa a flusso laminare biosicurezza per evitare la contaminazione microbica dei campioni di midollo osseo durante la lavorazione. Quando si lavora con materiale umano potenzialmente infetto, è consigliato l'uso di guanti protettivi e una gestione attenta.
- Inserire un filtro 100 micron cella sulla cima di una provetta sterile da 50 ml. Versare con cautela l'aspirato midollare attraverso il filtro delle cellule, inclinando il filtro o spostamento in materiale coagulo. Utilizzare un puntale sterile permigliore flusso attraverso le maglie del filtro.
NOTA: Evitare qualsiasi diluizione del coagulo, ad esempio, lavando il coagulo con PBS. Urokinase agisce indirettamente e richiede componenti del siero (es., Del plasminogeno) dalla biopsia per un'efficace digest. Continuando la procedura con il materiale del coagulo, il filtrato può essere conservato a temperatura ambiente fino a nuovo uso nel passo 3.6. - Trasferire il materiale coagulo midollo osseo in un piatto di coltura cellulare vuota con pinza sterile. Tagliare i detriti in piccoli pezzi di circa 2 mm 3 utilizzando un bisturi sterile.
- Trasferire i piccoli pezzi di coagulo in una provetta da 50 ml utilizzando le pinze sterili. Assicurarsi che il coagulo tritato ha un aspetto bagnato. Se sembra essere asciutto, utilizzare alcune delle filtrato dal punto 3.1 per inumidire.
- Triturare il coagulo pipettando su e giù per 5 volte con un 5 ml microtitolo pipetta. Aggiungere 1 aliquota urochinasi al campione. Incubare per 30 minuti a 37 ° C sia a bagnomaria o inun scuotimento (leggermente) incubatore.
- Triturare pipettando su e giù per 5 volte con una pipetta 5 ml. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza. Incubare per altri 30 min a 37 ° C. Dopo l'incubazione, triturare ancora 5 volte con un 5 ml pipetta. Passare su una nuova 100 micron filtro cella di mettere in comune con il filtrato dal punto 3.2.
- Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in media come descritto di seguito o secondo la procedura standard di laboratorio per la cultura espansione MSC.
4. Semina per la Cultura di espansione cellulare e Piastre CFU
- Risospendere le cellule (comprensivi di eritrociti e cellule mononucleari) in 50 ml di terreno di base: Alpha-MEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 2,5 mg / ml di amfotericina B . Contare le cellule 01:10 diluito in soluzione Trypan Blue con un chambe Neubauerr.
- Piastra le cellule in fiasche di coltura cellulare alla densità di 5 x 10 7 cellule / cm 2 e incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C. Se disponibile, utilizzare ipossiche (5% di ossigeno) condizioni. Per il controllo del test CFU, piatto 10 9 cellule in un piatto di coltura cellulare di 10 cm di diametro.
- Dopo 3 giorni di coltura, le cellule staminali mesenchimali sono fissate al piatto di coltura cellulare, mentre altre cellule rimangono in sospensione. Cambiare la media con terreno base integrato con 5 ng / ml di base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Per il controllo del test CFU, trattare il piatto di coltura cellulare allo stesso modo.
- Continuare coltura cellulare per un totale di 2 settimane, scambiando supporti tre volte alla settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, raggruppati per tripsinizzazione. Per il controllo del dosaggio CFU, scambiare media similmente, ma non dividere le celle per il corso di due settimane.
5. Giemsa per Assay CFU
- Preparare 10 ml di Giemsa soluzione per ogni piatto: dilute soluzione di riserva (7,6 g / l Giemsa in glicerolo: metanolo) 1:10 in acqua sterile (preparare sempre una diluizione di lavoro fresco).
- Rimuovere il supporto dal piatto di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS. Essere molto precautious quando si applica il liquido alla capsula di Petri e di evitare lavare via le cellule.
- Fissare cellule in metanolo puro per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il metanolo. Aggiungere la Giemsa soluzione e incubare per 60 minuti in un incubatore umidificato a 37 ° C.
- Lavare due volte con PBS. Far asciugare il capo piastra prima su un tovagliolo di carta. Contare le colonie manualmente. Ciò si ottiene con un pennarello sul retro della piastra.
6. MSC Differenziazione
- MSC Canine differenziazione
NOTA: MSC Canine sono state differenziate in condrogenica, osteogenico e lignaggi adipogenico dalla stimolazione con il supporto appropriato per quattro settimane. - Per Differenziazione adipogenico, MSC cultura in monostrato a 4 x 10 5 cells / cm 2 alternando due diverse condizioni di coltura come segue;
- Culture in mezzi di manutenzione adipogenesi contenente DMEM + Glutamax, 3% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B e insulina 170 mM.
- Cultura in adipogenesi mezzi indurre con terreno di mantenimento integrato con il 3% FBS, siero di coniglio 5%, 1 micron desametasone, a 500 micron 3 Isobutyl-1-metilxantina, 33 micron biotina, 5 micron rosiglitazone e 17 micron pantotenato 16.
- Revel le goccioline lipidiche dalla colorazione con Oil Red-O. In breve, riparare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchiare con il 0,35% di olio O rosso in isopropanolo.
- Per la cultura differenziazione osteogenica MSC in monostrato a 7 x 10 3 cellule / cm 2 e stimolare il seguente:
- Avanzata DMEM (GIBCO) + Glutamax, 5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B, 501; M di acido L-ascorbico 2-fosfato 10 mM ß-glicerofosfato e 100 nM desametasone.
- Identificare i depositi di mineralizzazione di macchia Von Kossa (5% AgNO 3). In breve, fissare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchia con 5% AgNO 3 in acqua distillata.
- Differenziazione condrogeniche
- Cubi Cut (3 mm per lato) da un dispositivo medico a forma di spugna, costituite da liofilizzato collagene di tipo I, e utilizzati come materiale scaffold per sostenere le cellule 17.
- MSC seme sulla sommità dei cubetti alla concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml (~ 70.000 cellule / cubo).
- Prima dell'aggiunta di supporto, permettono alle cellule di aderire ai cubi per 30 min.
- Mantenere costrutti MSC-collagene nei media condrogenica comprensivi di DMEM / F12 + Glutamax, 2,5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 mg / ml di amfotericina B, 40 ng / desametasone ml, 50 mg / ml ascorbico acido 2-fosfato,50 mg / ml L-prolina, 1x Insulin-transferrina-Selenio X, e 10 ng / ml fattore di crescita trasformante-β1.
- Utilizzare Alcian colorazione blu di visualizzare l'accumulo di proteoglicani in costrutti sezioni. In breve, macchiare sezioni O / N con 0,4% blu Alcian sciolta in 0,01% H 2 SO 4 e 0,5 M guanidina cloridrato. Avanti, lavare le sezioni sono state lavate per 30 minuti nel 40% DMSO e 0,05M MgCl 2. Le cellule sono state di contrasto con rosso veloce nucleare.
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Risultati
I fatti che il 74% dei campioni di midollo osseo canino (n = 54) conteneva coaguli quando sono arrivati nel nostro laboratorio (Figura 1A) insieme con diminuzione dei rendimenti MSC da questi campioni, ci ha fatto credere che un numero considerevole di MSC era intrappolato all'interno dei coaguli . Infatti, un semplice DAPI-macchia di materiale coagulo sezionata conferma la presenza di cellule nucleate in alta densità (Figura 1B). Questo conduce infine a un basso numero di cellule...
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Discussione
Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati in laboratorio per l'elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni coag...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale Svizzera Grant CR3I3_140717/1 e dalla Fondazione Svizzera per Paraplegici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| medi basali | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| umano FGF-base | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha con nucleoside, con glutammina stabile | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Amimed inattivato a caldo | 2-01F36-I | ||
| Amfotericina B | Applichem | A1907 | |
| medi adipogenici | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| Siero di coniglio | Gibco | 16120099 | |
| Desametasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantotenato | Sigma | P5155 | |
| Olio Rosso-O | Sigma | O0625 | |
| Componenti medi osteogenici Acido | |||
| L-ascorbico 2-fosfato | Sigma | A8960 | |
| ß-glicerofosfato | Sigma | G9422 | |
| Nitrato d'argento (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Componenti | |||
| Biopad - dispositivo medico a forma di spugna | Euroresearch | ||
| L-prolina | Sigma | P5607 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio X | Gibco | 51500056 | |
| Fattore di crescita trasformante umano-β 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nucleare veloce rosso | Sigma | N8002 | |
| Generico | |||
| Tri-Sodium citrato diidrato | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urochinasi | Medac | 1976826 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Colorazione di Giemsa | Applichem | A0885 | |
| Formaldeide | Applichem | A0877 | |
| Acido solforico (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidina cloridrato | Applichem | A1499 | |
| Materiali di consumo Provetta | |||
| reazione da 50 ml | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| Siringa da 10 ml | Braun | 4606108V | |
| Ago Sterican (22G) | Braun | 4657624 | |
| Microprovette da 1,7 ml | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ filtro cellulare m | Falcon | 6.05935 | |
| pinza sterile | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| bisturi sterile | Braun | 5518059 | |
| Primaria piatto di coltura cellulare | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| pallone per colture cellulari - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Attrezzatura | |||
| Cabina di biosicurezza microbiologica classe II | Skan | 82011500 | |
| bagnomaria | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Pipetta sierologica 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscopio | Olympus | CKX41 | |
| incubatore umidificato Heracells 240 | Thermo 51026331 | ||
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
