Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata del trapianto di timo murino da diversi topi donatori anziani sotto la capsula renale di riceventi di topi immunodeficienti. L'obiettivo di questo approccio è quello di modellare lo sviluppo delle cellule T e gli eventi di selezione timica in vivo.
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Articolo metodologico
Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I meccanismi che regolano l'efficacia della selezione timica restano mal definiti. Il metodo qui presentato permette in vivo analisi dello sviluppo e selezione di cellule T specifiche per sé e antigeni estranei. L'approccio prevede l'impianto di innesti timici derivate da diversi topi anziani in riceventi SCID immunodeficienti. Nel corso di un periodo relativamente breve di tempo i destinatari sono completamente ricostituiti con cellule T derivate dal trapianto del timo impiantata. Solo timociti semina timo al momento della selezione subiscono isolamento e svilupparsi in cellule T mature. Come tali, i cambiamenti nella natura e la specificità delle cellule T trapiantate in funzione di eventi timici dipendenti dall'età possono essere valutate. Anche se è richiesta competenza tecnica per il trapianto timica successo, questo metodo fornisce una strategia unica di studiare in vivo una vasta gamma di patologie che sono causa o il risultato di aberrant funzione e / o homeostas timicoè.
Introduzione
Il timo è un organo in cui gli eventi critici nello sviluppo delle cellule T si verificano 1. Timociti residente sul riarrangiamento del recettore delle cellule T (TCR) α e β geni, subiscono una serie di interazioni con lymphostromal e cellule presentanti l'antigene (APC) nelle regioni corticali e midollari del timo 2. Thymic selezione positiva è mediata da cellule epiteliali corticali timici (TEC) per produrre timociti che riconoscono peptidi antigenici nell'ambito dell'ospite classe complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) I e II molecole 2-3. Successivamente timica selezione negativa comporta spurgo dei timociti au....
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Protocollo
Gli studi murini sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della University of North Carolina a Chapel Hill e tutte le cure degli animali era in conformità con le linee guida IACUC.
1. Preparazione del neonato e Adult Thymi
- Preparare tutti i reagenti e le attrezzature prima di eutanasia topi donatori.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave o altri metodi appropriati. Tutte le procedure chirurgiche sono svolte sotto una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili ed evitare la contaminazione. Montare gli strumenti necessari per l'estrazione di thymi da topi donatori.
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Risultati
Il successo di questa procedura dipende trauma chirurgico minimo nonché il posizionamento accurato del graft sotto la capsula renale. L'innesto timica deve essere tagliato per assicurare dimensioni appropriate sezioni timici per il successivo trapianto, come mostrato in Figura 1. Seguendo lo schema di figura 1, thymi da topi neonati o adulti può essere usato per il trapianto subcapsular successo con risultati costanti e riproducibili attecchimento delle cellule T. Come accennato, ad.......
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Discussione
Gli eventi che regolano la selezione timica sono poco conosciuti. Studi recenti hanno dimostrato cambiamenti ontogenici nell'efficienza della selezione. L'accoppiamento di questo approccio con diversi topi donatori e riceventi di timo transgenico faciliterà ulteriormente gli studi per identificare gli eventi e i parametri che regolano la selezione timica. In particolare, il trapianto di timo viene utilizzato per il trattamento e la gestione delle malattie delle cellule T e del timo osservate, ad esempio, nei neonati atim.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti ricevuti dal National Institutes of Health (1R01AI083269).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Etanolo | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Soluzione di betadina | Prodotti Purdue | 67618-150-17 | |
| Ago calibro 18 | BD | 305195 | |
| Suture (1.0 metrico) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Clip per ferite (9mm) | Clay Adams® Pipetta di | 427631 | |
| marca Fisher Scientific | 13-711-20 | Mouse | |
| anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Topo anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Topo anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancetta | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, sale di trietilammonio | Invitrogen | P30253 | |
| Piastre in polipropilene a 96 pozzetti con fondo rotondo | Corning | 3365 | |
| Provette a grappolo in polipropilene da 1,2 ml | Corning | 4401 | |
| Provette in polipropilene da 5 ml | 352002 | ||
| 40uM Nylon Cell Filtro | Falcon | 352340 | |
| Soluzione di paraformaldeide al 16%, | servizi di microscopia elettronica | 15710 | |
| Unguento ottico Puralube | Scientific | NC0138063 | |
| Linfolita | Cedarlano | CL5030 | |
| Piatto per colture cellulari da 60 mm | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, sterile |
Riferimenti
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
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Ristampe e permessi
Tag
Trapianto di innesto timicoisolamento del timo murinoimpianto nella capsula renaleanalisi tramite citometria a flussovalutazione dell'attecchimento delle cellule Ttopi riceventi immunodeficientistudio della selezione timicaposizionamento chirurgico dell'innestoricostituzione delle cellule T perifericheeventi timici età-dipendenti
