Articolo metodologico
Il sistema nervoso enterico è formato da cellule della cresta neurale che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino. Le cellule della cresta neurale si differenziano in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo di neurotrasmettitore. Questo protocollo descrive una tecnica per la dissezione, il fissaggio e l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale embrionale murino per visualizzare l'espressione dei neurotrasmettitori del sistema nervoso enterico.
Il sistema nervoso enterico è formato da cellule della cresta neurale che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino. Dopo la colonizzazione, le cellule della cresta neurale devono quindi differenziarsi in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo di neurotrasmettitore. I neuroni colinergici, un importante fenotipo di neurotrasmettitore nel sistema nervoso enterico, vengono identificati mediante colorazione per la colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima che sintetizza l'acetilcolina. Gli sforzi storici per visualizzare i neuroni colinergici sono stati ostacolati da anticorpi con diverse specificità per il sistema nervoso centrale rispetto al sistema nervoso periferico ChAT. Noi e altri abbiamo superato questa limitazione utilizzando un anticorpo contro la ChAT placentare, che riconosce sia la ChAT centrale che quella periferica, per visualizzare con successo i neuroni colinergici enterici embrionali. Inoltre, abbiamo confrontato questo anticorpo con i reporter genetici per ChAT e abbiamo dimostrato che l'anticorpo è più affidabile durante l'embriogenesi. Questo protocollo descrive una tecnica per la dissezione, il fissaggio e l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale embrionale murino per visualizzare l'espressione dei neurotrasmettitori del sistema nervoso enterico.
Un funzionamento del sistema nervoso enterico (ENS), che controlla la motilità, l'assorbimento dei nutrienti, e il flusso sanguigno locale, è essenziale per la vita 1. L'ENS è formata da cellule della cresta neurale (NCC) che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino, dove si differenziano in gangli contenente neuroni e cellule gliali. Malattia di Hirschsprung (HSCR, online eredità mendeliana in Man), una malattia congenita multigeneic con un'incidenza di 1 su 4.000 nati vivi, può essere considerato il prototipo per lo studio della malattia formazione ENS perturbato. In HSCR, NCC non riescono a migrare verso e colonizzare lunghezze var....
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L'Università del Wisconsin Animal Care and Use Committee ha approvato tutte le procedure.
1. preparazione di soluzioni
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Abbiamo già descritto la generazione di topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti GFP e tdTomato che rilevano espressione ChAT 14. In breve, i topi Chat-Cre sono stati accoppiati con R26R: floxSTOP: tdTomato animali per produrre chat Cre; R26R: topi tdTomato (chiamati ChAT-Cre tdTomato): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter Chat-GFP. Gli embrioni sono stati isolati e tessuti sono stati sezionati prima di.......
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Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i difetti intestinali in HSCR non sono limitati al colon agangliare ma esteso prossimalmente, anche nel piccolo intestino ganglionated 5,15,16. Queste alterazioni sono cambiamenti nella ENS neuronale densità e neurotrasmettitore fenotipo e possono rappresentare dismotilità che è stata osservata nei pazienti con HSCR. Abbiamo utilizzato le tecniche di cui sopra nei nostri sforzi per comprendere le determinanti della formazione ENS. In particolare, queste tecni.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato supportato bythe americana Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) e il National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Ossoide | BR0014G | |
| Saccarosio | Fisher | S2 | |
| Azoturo di sodio | Fisher | BP9221 | |
| Albumina sierica bovina | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Piastre di Petri | Fisher | FB0875713A | |
| Microscopio a fluorescenza | Stereoscopio | Nikon SMZ-18 | |
| Microscopio a dissezione | Stereoscopio | Nikon SMZ-18 | |
| Pinze fini | Strumenti per la scienza | 11252-20 | |
| Provette Eppendorf da 1,5 ml | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Vetrini Fisher | 12-550-15 | ||
| Vetro di copertura | VWR | 16004-330 | |
| Microscopio confocale | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
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