Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Summary

Dettagli Questo protocollo di un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV), piccole particelle membranose rilasciate dalle cellule, da un minimo di 10 campioni di siero microlitri. Questo approccio elude la necessità di ultracentrifugazione, richiede solo pochi minuti di tempo di saggio, e permette l'isolamento di EVs da campioni di volumi limitati.

Abstract

Vescicole extracellulari (SVE), particelle membranose rilasciate da vari tipi di cellule, in possesso di un grande potenziale per le applicazioni cliniche. Essi contengono acidi nucleici e proteine ​​carico e sono sempre più riconosciuti come un mezzo di comunicazione intercellulare utilizzato sia da eucarioti e cellule procariote. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni, attuali protocolli per l'isolamento di EVs sono spesso molto tempo, ingombrante, e richiedono grandi volumi di campione e attrezzature costose, come un'ultracentrifuga. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una piattaforma immunoaffinità cartaceo per la separazione sottogruppi di veicoli elettrici che è facile, efficiente, e richiede volumi di campione a partire da 10 ml. I campioni biologici possono essere pipettati direttamente su aree di prova di carta che sono stati modificati chimicamente con le molecole di cattura che hanno alta affinità per specifici marcatori di superficie EV. Abbiamo la convalida del saggio utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), a base di carta immunosorben enzimaticot test (P-ELISA), e l'analisi del trascrittoma. Questi dispositivi cartacei consentiranno lo studio dei veicoli elettrici nella clinica e l'impostazione della ricerca per far progredire la nostra comprensione delle funzioni EV in salute e malattia.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle membranose eterogenee che variano in dimensioni da 40 nm a 5.000 nm e vengono rilasciate attivamente da molti tipi di cellule attraverso diverse vie di biogenesi^1-9. Contengono sottoinsiemi unici e selezionati di DNA, RNA, proteine e marcatori di superficie provenienti da cellule parentali. Il loro coinvolgimento in una varietà di processi cellulari, come la comunicazione intercellulare¹⁰, la modulazione dell'immunit๹, l'angiogenesi¹², le metastasi¹², la chemioresistenza¹³ e lo sviluppo di malattie oculari⁹, è sempre più riconosciuto e ha stimolato un grande interesse per la loro utilità in applicazioni diagnostiche, prognostiche, terapeutiche e di biologia di base.

Le EV possono essere classicamente classificate come esosomi, microvescicole, corpi apoptotici, oncosomi, ectosomi, microparticelle, telerosomi, prostatosomi, cardiosomi e vesosomi, ecc., in base alla loro biogenesi o origine cellulare. Ad esempio, gli esosomi si formano in corpi multivescicolari, mentre le microvescicole sono generate dalla gemmazione direttamente dalla membrana plasmatica e le vescicole apoptotiche da cellule apoptotiche o necrotiche. Tuttavia, la nomenclatura è ancora poco affinata, in parte a causa della mancanza di una comprensione e caratterizzazione approfondita delle vescicole extracellulari. Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare le vescicole extracellulari, tra cui l'ultracentrifugazione¹⁴, l'ultrafiltrazione¹⁵, le biglie magnetiche¹⁶, la precipitazione polimerica^17-19 e le tecniche microfluidiche^20-22. La procedura più comune per purificare le vescicole extracellulari prevede una serie di centrifugazioni e/o filtrazioni per rimuovere detriti di grandi dimensioni e altri contaminanti cellulari, seguite da un'ultracentrifugazione finale ad alta velocità, un processo costoso, noioso e non specifico^14,23,24. Purtroppo, la necessità tecnologica di un isolamento rapido e affidabile dei veicoli elettrici con purezza ed efficienza soddisfacenti non è ancora soddisfatta.

Abbiamo sviluppato un dispositivo di immunoaffinità basato su carta che fornisce un modo semplice, economico in termini di tempo e costi, ma efficiente per isolare e caratterizzare sottogruppi di EV²². La carta di cellulosa tagliata in una forma definita può essere disposta e laminata utilizzando due fogli di plastica con fori passanti registrati. In contrasto con la strategia generale di definire il confine del fluido nei dispositivi a base di carta stampando cera idrofobica o polimeri^25-27, questi modelli di carta laminata sono resistenti a molti liquidi organici, incluso l'etanolo. Le zone di test su carta sono modificate chimicamente per fornire una copertura stabile e densa di molecole di cattura (ad esempio, anticorpi specifici per il bersaglio) che hanno un'elevata affinità per specifici marcatori di superficie su sottogruppi EV. I campioni biologici possono essere pipettati direttamente sulle zone di test della carta e le vescicole extracellulari purificate vengono trattenute dopo le fasi di risciacquo. La caratterizzazione delle vescicole extracellulari isolate può essere eseguita mediante SEM, ELISA e analisi trascrittomica.

Protocol

Uno schema generale della procedura operativa è prevista in Figura 1. Utilizzando pratiche etiche, abbiamo raccolto campioni di sangue di soggetti sani, e ottenuto campioni di umore acqueo pazienti attraverso la Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sotto IRB approvato protocolli ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Realizzazione di dispositivi di carta

1. Tagliare la carta per cromatografia in cerchi di 5 mm di diametro per fornire lo stesso layout come una micropiastra a 96 pozzetti. Sandwich questi pezzi di carta con due fogli di polistirolo con sede fori passanti, e laminato.
2. Modificare i dispositivi di carta con il metodo coniugazione chimica descritto nei passaggi seguenti ^28.
   1. Trattare dispositivi di carta con plasma di ossigeno (100 mW, 1% di ossigeno, 30 sec) in una camera di plasma.
      ATTENZIONE: Particolare cautela deve essere presa quando si lavora con 3 mercaptopropil trimetossisilano e N--γ maleimidobutyryloxy succinimmideestere (GMBS), poiché entrambi sono sensibili all'umidità e tossici. Indossare guanti protettivi ed evitare l'inalazione o contatto con la pelle e gli occhi. Tenere il flacone magazzino ben chiuso e lasciarlo equilibrare a RT prima di aprire per evitare la formazione di condensa. In alternativa, aprire la bottiglia stock all'interno di un sacchetto guanto di azoto riempito o scatola. Aliquota in piccole fiale per evitare frequente apertura della bottiglia stock.
   2. Subito Incubare trattati dispositivi di carta in un (v / v) soluzione al 4% di 3-mercaptopropil trimetossisilano in etanolo (200 proof) per 30 min.
   3. Risciacquare dispositivi di carta con etanolo e incubare con 0,01 mmol / GMBS ml in etanolo per 15 min.
   4. Sciacquare con etanolo (200 proof) e incubare dispositivi di carta con 10 mg / ml soluzione avidina in tampone fosfato (PBS) per 1 ora a 4 ° C. Conservare a 4 ° C, se necessario, e utilizzare entro 4 settimane.
3. Bagnare ogni zona di prova di carta con 10 microlitri PBS contenente 1% (w / v) di albumina sierica bovina (BSA) Per 3 × 10 min prima di avvistare 10 ml biotinilati molecole di cattura per 3 × 10 min. Utilizzare l'anticorpo anti-CD63 (20 ug / ml in PBS contenente 1% (w / v) BSA e 0,09% (w / v) di sodio azide) o annessina V (1:20, v / v in annessina V binding buffer) come molecole di cattura.
4. Risciacquare anticorpi o annessina V molecole anti-CD63 non legati con 10 microlitri corrispondente PBS contenente 1% (w / v) BSA o annessina V soluzioni tampone vincolante per 3 × 1 min, rispettivamente.

2. siero e acqueo Umore Raccolta e lavorazione

1. Collezione Serum.
   1. Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in tubi di siero di separazione e capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte. Impostare il tubo in posizione verticale e attendere 30 min.
   2. Centrifugare a 1.200 xg per 15 min. Trasferire il siero di strato superiore in una provetta pulita, e centrifugare di nuovo a 3.000 xg per 30 min.
   3. Passare il surnatante con un fil di 0,8 micronter. Mantenere il campione a -80 ° C fino al momento dell'uso.
2. Collezione umore acqueo: raccogliere campioni di umore acqueo pazienti diagnosticati da un oculista direttamente attraverso procedure e conservare i campioni invasiva a -80 ° C fino al momento dell'uso.

3. Isolamento di extracellulare vescicole

1. Campioni Spot su ogni zona di prova di carta a una velocità di 5 ml / min.
2. Risciacquare veicoli elettrici non legati con 10 ml corrispondenti PBS contenente 1% (w / v) BSA o annexin V vincolante soluzioni tampone per 3 × 1 min per dispositivi carta funzionalizzati con molecole di anticorpi o annessina V anti-CD63, rispettivamente. Eseguire le seguenti saggi a valle.

4. valle Assay Esempio 1: Electromicrographs scansione

1. Fissare EV catturati su funzionalizzata zona di prova di carta utilizzando 10 microlitri 0,5 × fissante di Karnovsky per 10 min.
2. Sciacquare i campioni con ampio PBS per 2 × 5 min.
3. Disidratare ilcampioni con conseguente 35% di etanolo per 10 min, 50% di etanolo per 2 × 10 min, 70% di etanolo per 2 × 10 min, 95% di etanolo per 2 × 10 min, e il 100% di etanolo per 4 × 10 min.
4. Critical asciutto e sputtering rivestire i campioni con palladio / oro, ed esaminare con un microscopio elettronico a scansione funzionare a bassa tensione di accelerazione di elettroni (~ 5 kV).

5. valle Assay Esempio 2: a base di carta ELISA

1. Aggiungere una soluzione 5 ml contenente anticorpo primario anti-CD9 a 1: 1.000 di diluizione in PBS per ogni zona di prova contenente EV catturati. Attendere 1 min.
2. Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
3. Aggiungere a 5 ml soluzione contenente perossidasi (HRP) -linked anticorpo secondario a 1: 1.000 di diluizione in PBS e attendere 1 min.
4. Risciacquare i campioni con 30 ml di PBS agitata a 100 rpm per 30 sec.
5. Aggiungere un substrato colorimetrico 5 microlitri contenente rapporto 1: 1 volume di idrogeno perossido di und 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e la scansione con uno scanner da tavolo.

6. A valle Assay Esempio 3: RNA Isolation

1. Immergere i campioni in 35 ml di aiuti isolamento RNA a base polivinilpirrolidone-e 265 ml di lisi / binding buffer per la lisi EV catturati. Vortex vigorosamente.
2. Aggiungere 30 microlitri omogenato fornito nel kit di isolamento al lisato. Vortex energicamente e mettere in ghiaccio per 10 min.
3. Estrarre l'RNA utilizzando acido separazione fenolo-cloroformio descritto nei seguenti passaggi.
   1. Prendere 330 ml di fenolo-cloroformio dallo strato fondo della bottiglia e aggiungere al omogenato / lisato. Vortex vigorosamente.
   2. Centrifugare a 10.000 xg per 5 min. Trasferire la fase acquosa (superiore) in una provetta pulita e notare il volume rimosso.
4. Precipitare il RNA totale con il 100% di etanolo del volume che è 1,25 volte il volume della fase acquosa rimossa nel passaggio precedente e collect l'RNA nella soluzione di eluizione preriscaldato a 95 ° C.
5. Concentrato e purificare ulteriormente l'RNA utilizzando un kit di RNA di pulizia secondo il protocollo del produttore.

Results

La capacità del dispositivo di carta per isolare sottogruppi di veicoli elettrici si basa in modo efficiente sul suo riconoscimento sensibile e specifico di marcatori di superficie EV. La modifica stabile di fibre di carta con molecole di cattura è ottenuto utilizzando la chimica avidina-biotina come descritto altrove ^28-30. L'efficacia di coniugazione chimica e quella del metodo fisisorbimento è valutata utilizzando letture basati sulla fluorescenza. Le zone di prova carta vengono preparati seguendo passo pr...

Discussion

Le fasi più critiche per il successo isolamento di sottogruppi di vescicole extracellulari sono: 1) una buona scelta di carta; 2) di copertura stabile ed elevato di molecole di cattura sulla superficie delle fibre di carta; 3) la corretta manipolazione dei campioni; e 4) la pratica di laboratorio di igiene generale.

Materiali porosi sono stati utilizzati in molti saggi economici e senza attrezzatura. Essi possono avere dimensioni sintonizzabile pori, funzionalità versatile, a basso costo ed ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carta per cromatografia	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Carta di cellulosa di grado 1
(3-Mercaptopropil) trimetossisilano	Sigma Aldrich	175617	Questa sostanza chimica reagisce con l'acqua e l'umidità e deve essere applicata all'interno di un sacchetto per guanti riempito di azoto. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle. Non respirare fumi o inalare vapori.
Etanolo	Fisher Scientific	BP2818	Assoluto, 200 Proof, grado di biologia molecolare
Albumina sierica bovina (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	Spesso indicato come frazione di Cohn V.
N-γ-maleimidobutirrilossi succinimide estere (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS è un reticolante ammina-sulfidril. GMBS è sensibile all'umidità.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidin ha 4 siti di legame per la biotina e il suo valore pI è 6,3, che è più neutro dell'avidina nativa
Clone anti-CD63 anti-CD63 di topo biotinilato			AHN16.1/46-4-5
annessina biotinilata V	BD Biosciences	556418	Annxin V ha un'elevata affinità per la fosfatidilserina (PS)
Anti-CD9 primario e secondario sistema di anticorpi	Biosciences	EXOAB-CD9A-1	L'anticorpo secondario è costituito da provette per la separazione del siero coniugate con perossidazione di rafano
	BD Biosciences	367991	Attivatore di coaguli e gel per la separazione del siero Tampone
legante l'annessina V	BD Biosciences 556454		10 volte; diluire a 1 volta prima dell'uso.
Set di reagenti per substrato TMB	BD Biosciences	555214	Il set contiene perossido di idrogeno e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)
[header]
Kit di isolamento dell'RNA	Life Technologies	AM1560	Kit di isolamento dell'RNA MirVana
Ausilio per l'isolamento dell'RNA a base di polivinilpirrolidone	Life Technologies	AM9690	L'aiuto per l'isolamento dell'RNA vegetale contiene polivinilpirrolidone (PVP) che si lega ai polisaccaridi.
kit di pulizia dell'RNA	Qiagen Inc.	Il kit di pulizia dell'RNA MinElute 74004	è progettato per la purificazione fino a 45  μ g RNA.
Camera al plasma	March Instruments	PX-250
Microscopio elettronico a scansione	Hitachi Ltd.	Scanner desktop S-4300
	Hewlett-Packard Company Photosmart	B110	state acquisite immagini a colori a 8 bit. Possono essere utilizzate anche fotocamere e smartphone.
Sistema di registrazione immagini	J& Sono	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	. Possono essere utilizzati anche microscopi a fluroscenza.