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Articolo metodologico

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

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DOI:

10.3791/52724

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27 settembre 2015

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1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

In questo articolo

Sommario

Il controllo della sintesi proteica avviene principalmente nella fase di inizio della traduzione, le cui carenze sono legate a diversi disturbi. Per comprendere meglio la loro eziologia, abbiamo descritto qui un protocollo che utilizza ovociti di Xenopus laevis per valutare la traduzione del trascritto di mos in presenza di un mutante del fattore di inizio della traduzione eIF4G1.

Abstract

La sintesi proteica è un processo fondamentale per l'espressione genica impattare diversi processi biologici particolare adattamento alle condizioni ambientali. La fase di inizio, che prevede il montaggio delle subunità ribosomali del mRNA codone di iniziazione, iniziazione fattore coinvolto compreso eIF4G1. Difetti di questo fattore limitante della traduzione sono legate a disturbi diversi. Per studiare le possibili conseguenze di tali liberalizzazioni, Xenopus laevis oociti costituiscono un modello attraente con un alto grado di conservazione dei meccanismi cellulari e molecolari essenziali con umana. Inoltre, durante la maturazione meiotica, ovociti vengono trascrizionalmente repressi e tutte le proteine ​​necessarie sono stati tradotti dal preesistenti, mRNA di origine materna. Questo modello economico consente di mRNA esogena di diventare perfettamente integrati con una traduzione efficace. Qui viene descritto un protocollo per valutare traduzione con un fattore di interesse (qui eIF4G1) utilizzando storcato mRNA materno che sono il primo ad essere poliadenilato e tradotti durante la maturazione degli ovociti come una lettura fisiologico. In un primo momento, mRNA sintetizzato mediante trascrizione in vitro di plasmidi di interesse (qui eIF4G1) vengono iniettati in ovociti e cinetica di maturazione degli ovociti di rilevamento Ripartizione Germinal Vesicle è determinata. Il target mRNA materno studiato è la serina / treonina mos-proteina-chinasi. La sua poliadenilazione e la sua successiva traduzione sono studiati insieme con l'espressione e la fosforilazione delle proteine ​​dei mos segnalazione cascata coinvolti nella maturazione degli ovociti. Variazioni del protocollo corrente a presentare difetti traslazionali sono proposti anche per sottolineare la sua applicabilità generale. Alla luce delle prove che aberrante la sintesi proteica può essere coinvolto nella patogenesi di disordini neurologici emergenti, tale modello offre l'opportunità di valutare facilmente questo deterioramento e identificare nuovi bersagli.

Introduzione

Le proteine ​​sono elementi essenziali della vita cellulare, e quindi a più ampia scala dell'organismo. Essi assicurano la maggior parte delle funzioni cellulari tra cui struttura, il trasporto, la reazione di catalisi, regolazione, ecc genica La loro espressione è il risultato di un complesso meccanismo di traduzione che consente la conversione di un mRNA in proteine. La traduzione viene sottoposta a diversi controlli di adattarsi e di regolare l'espressione genica secondo le esigenze cellulari, durante lo sviluppo e differenziamento, invecchiamento, stress fisiologici o manifestazioni patologiche.

Traduzione è diviso in 3 fasi (inizio, allungamento e terminazione) e presenta 3 sistemi di traduzione iniziazione al fine di rispondere a queste esigenze: cap-dipendente, cap-indipendenti con interno ribosoma Entry Segment (IRES) strutture ed esaltatori di traduzione cap-indipendente ( CITE).

La maggior parte dei mRNA eucarioti sono tradotti in un cap-Dependent modo tramite il 7-methylguanosine cap 5'-trifosfato, che serve come una funzione di riconoscimento durante la sintesi proteica. Questo cappuccio si lega a eIF4E, un componente del complesso eIF4F con eIF4G1 e eIF4A. Associato con altri partner come poli (A) binding protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, questi fattori inizio della traduzione permette di circularize mRNA e migliorarne l'accessibilità a forme 43S complesso fino a quando l'inizio codone AUG riconoscimento 1. Questo evento corrisponde alla fine del cioè inizio della traduzione, il primo passo della traduzione.

Traduzione Cap-indipendente è utilizzato da codifica mRNA per proteine ​​essenziali in condizioni di stress che inducono per la proliferazione cellulare e l'apoptosi esempio. Questo meccanismo coinvolge strutture secondarie in mRNA 5'regione non tradotta (UTR) chiamato IRES, l'estremità carbossi-terminale di eIF4G1 associata con eIF4A e il complesso 43S. Il legame di questo 43S di pre-apertura complex all'IRES inizia il tappo traduzione indipendente senza la necessità di fattore eIF4E 2,3.

Infine, un altro meccanismo di traduzione ancora non ben compreso supporta questa attività di traduzione cap-indipendente in condizioni di stress attraverso CITE strutture situate all'interno mRNA UTR 4.

Attraverso queste diverse modalità di traduzione diverso da loro passi di iniziazione, la traduzione gioca un ruolo fondamentale nella omeostasi cellulare e qualsiasi modifica di uno di questi processi sarebbe quindi un impatto l'organismo con piccole e gli effetti su larga scala. In effetti, l'avvio è un fattore limitante che disciplina i processi di traduzione corretta di mRNA in proteine ​​ed è quindi l'obiettivo di numerosi controlli e punti di regolazione 5. Sia che si tratti per quest'ultimo o per i componenti di questi processi, se si risulta essere difettoso, sarà perturbare l'equilibrio stabilito nella cella e quindi potrebbe portare a Condi patologicazioni. In questo contesto, le mutazioni in fattori di traduzione sono stati coinvolti in diverse patologie, tra cui malattie neurodegenerative come `leucoencefalopatia con vanishing bianco matter' (eIF2B1-5 subunità) 6, nella sindrome di Walcott-Rallison (gene che codifica per EIF2AK3 PERK) 7, potenzialmente in malattia (eIF4G1 p.R1205H) di Parkinson 8. E 'quindi importante per condurre studi cellulari e molecolari di queste proteine ​​mutanti di aumentare le nostre conoscenze sullo sviluppo della malattia e sul processo generale di inizio della traduzione.

Per eseguire questi studi, è fondamentale scegliere i modelli più adeguati per osservare le conseguenze di queste mutazioni Xenopus laevis oociti sono particolarmente adatti per le loro proprietà fisiologiche e biochimiche. Sincronicità fisiologica (bloccato in fase G2 del ciclo cellulare) , elevata capacità di sintesi proteica (200-400 ng / giorno / ovocita), elevato numero di OOC estrattoytes da uno stesso animale (800-1000 ovociti / femmina) e la dimensione della cella (1,2-1,4 mm di diametro) che facilita la loro manipolazione. Microiniezione degli ovociti di Xenopus con sintetizzato mRNA può essere facilmente eseguita per sezionare passi di traduzione. In questa vista si presenta altri vantaggi. Data la velocità di progressione meiosi e della traduzione dell'mRNA dopo microiniezione (~ 24 ore), Xenopus ovociti rappresenta un sistema veloce rispetto ai sistemi ricostituiti cellulari (estratti da E.coli, germi di grano o di coniglio reticolociti ...) in cui un mRNA è tradotto con un tasso di traduzione ridotta e ad una velocità inferiore. Quindi, gli effetti di una mutazione introdotta in un mRNA saranno rapidamente e facilmente osservabile studiato in molti ovociti. Un altro vantaggio di ovociti di Xenopus è che mRNA materni sono latenti e la traduzione delle proteine ​​è bloccato prima della stimolazione progesterone. L'aggiunta di progesterone è quindi un buon mezzo per controllare l'induzione di traduzione. Citoplasmatica polyadenylation non si verifica durante l'oogenesi. Inizia la maturazione degli ovociti in durante ovociti progesterone stimolata in un ordine temporale e continua durante tutto lo sviluppo precoce e potrebbe essere utilizzato per studiare le diverse fasi della traduzione.

La poliadenilazione di mos mRNA è tra i primi a verificarsi e appartiene con Aurora A / Eg2, istoni-Like B4 mRNA alla classe dei geni "di maturazione precoce" come definite nel Charlesworth et al. (2004) 9. L'induzione di traslazione dell'mRNA "tardive", come ciclina A1 e ciclina B1 si verifica intorno al momento della ripartizione vescicola germinale (GVBD). Mos mRNA codifica per una chinasi serina / treonina-proteine. La sua traduzione è di fondamentale importanza in quanto induce la chinasi MAP cascata che attiva indirettamente la maturazione dell'ovocita. Infatti, in risposta al progesterone, poliadenilazione di mRNA mos è migliorata tramite un processo che coinvolge Aurora A / Eg2 proteine ​​regolatrici e di altre proteine ​​di legame con RNA the 3'UTR di mRNA mos. Questo aumento di poliadenilazione mos mRNA porta ad un aumento del livello di proteina MOS, che a sua volta attiva MEK1. Questo processo media l'attivazione della chinasi di segnalazione regolata extracellulare 2 (ERK2) (Figura 1). Questa cascata di segnalazione può quindi innescare la maturazione fase M promuovere fattori, un complesso formato da ciclina B e Cdc2 chinasi, e alla fine si traduce in ripresa meiotica.

Quindi in Xenopus laevis ovociti, lo studio di mRNA materni quali mesi potrebbe facilmente essere usato per testare la loro traducibilità con diversi endpoint dal loro poliadenilazione efficiente alla traduzione di alcuni mesi di segnalazione componenti, tra cui anche la determinazione del tasso GVBD. Questo sistema è quindi interessante valutare le prime conseguenze delle mutazioni dei fattori di inizio della traduzione senza interferenze di recente trascritto mRNA o di efficienza di trasfezione, i problemi spesso si verificano con eukarystudi sulle cellule otic.

Qui, un protocollo si stabilisce dove mRNA eIF4G1 mutanti sono microiniettati in Xenopus laevis ovociti e la traduzione di mRNA materno è testato. In presenza di un difetto nel GVBD progressione, mos mRNA poliadenilazione che è essenziale per la progressione attraverso il ciclo cellulare meiotica ovocita e per la successiva traduzione di mRNA precoci e tardivi classe è accertata. La fosforilazione Aurora A / Eg2 e ERK è anche studiato per confermare la conseguenza di mos deregulation.Thus, ovociti di Xenopus rappresentano un modo semplice per analizzare diverse fasi di traduzione dell'mRNA.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti Xenopus allo stabulario del Lille 1 Università secondo le regole degli orientamenti del Consiglio della Comunità europea (86/609 / CEE) per la sperimentazione degli animali da laboratorio. Il protocollo di origine animale è stato approvato dal comitato istituzionale di revisione locale (Comité d'Ethique en Sperimentazione animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).

1. Gestione degli ovociti

  1. Preparare la soluzione di anestetico: sciogliere 1 g di tricaine metansolfonato polvere in un 1 L di acqua sterile.
  2. Plunge femminile Xenopus laevis in questa soluzione, coprire il bicchiere per evitare la fuga e attendere circa 45 minuti per l'animale di essere completamente sedato (senza alcuna reazione a un pizzico gamba).
  3. Lavare la rana con sapone e risciacquare con acqua corrente poi posto l'animale sul dorso su un foglio di alluminio pulito.
  4. Fissare la pelle della parte laterale dell'addome ea livello ovaie con una pinza.Effettuare un'incisione di circa 1 cm con le forbici puliti prima di utilizzarlo con etanolo al 70%. Assicurarsi che la sezione è abbastanza profonda e per raggiungere la parete addominale sottostante per permettere l'asportazione del tessuto ovarico in cui si trovano diversi ovociti in varie fasi di sviluppo.
  5. Sezionare i lobi ovaio, lavarli 4 volte in una capsula di Petri (50 mm) con ND96 media (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES a pH 7,4 con NaOH, integrato con 50 ug / ml di streptomicina / penicillina, 225 mg / ml di sodio piruvato, 30 ug / ml inibitore della tripsina di soia, 1 ml / ml di tetraciclina) per rimuovere tutte le tracce di sangue e detriti.
    Nota: Tetraciclina consente una conservazione ottimale e un buon recupero dopo il trattamento microiniezione.
  6. Memorizzarli in una capsula Petri coperta sommerso nel mezzo a 14 ° C, consentendo la loro conservazione per una settimana.
  7. Stitch la parete addominale e la pelle con veterinario riassorbibile thread e un ago sutura (3 o 4 punti di sutura saranno necessari).
  8. Posto l'animale in un bicchiere d'acqua e umido, senza la pelle con acqua di rubinetto fino a quando la rana è di nuovo in movimento. Coprire il bicchiere per evitare la fuga.
  9. Separare con attenzione i lobi ovaio nel mezzo in gruppi da 5 a 10 ovociti tramite 2 coppie di pinze allo stereomicroscopio con un ingrandimento di 10 volte. Selezionare ovociti allo stadio VI. Essi possono essere riconosciuti: i) la loro forma e colore con un marrone polo animale pigmentato e giallo polo vegetativo separati da una fascia chiara ii) la loro dimensione superiore a 1,2 mm di diametro 10.
  10. Incubare le ovociti selezionati in una soluzione di collagenasi (1 mg / ml di collagenasi A da Clostridium histolyticum, disciolto in ND96 senza tetraciclina) in una capsula di Petri sotto blanda agitazione durante 45 min per facilitare il defolliculation ovocita (collagenasi digerisce connessioni delle cellule follicolari ovociti /). Lavare la oociti 3 o 4 volte con ND96 medio mantenuti a 14° C.
    Nota: Non incubare gli ovociti meno o più di 45 minuti a causa del rischio di distruggere proteine ​​di superficie dell'ovocita e di provocare scarsa redditività. Trattamento Collagenase può indurre GVBD spontanea.
  11. Incubare ovociti nel medio per 3-4 ore. Rimuovere le cellule follicolari con una pinzetta sottile sotto lente di ingrandimento binoculare e tenerli a 19 ° C in ND96 medio.

2. Preparazione dell'mRNA Sintesi

  1. Linearizzare 5 mg dei seguenti plasmidi per digestione enzimatica utilizzando Pme io enzima.
    NOTA: pcDNA6.2 / V5-dest contenente un amminoacidi eIF4G1 cDNA wild type 1599 (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-dest contenente un cDNA dominante negativo eIF4G1 (eIF4G1-DN) con mutazioni c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - e c.2126T> G nella regione di interazione tra eIF4G1 e eIF4E alla posizione 612 al 618 della corrispondente proteina disturbare la interazione betweit eIF4G1 e eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contenente cloramfenicolo acetil transferasi (GFP). Preparare 2 miscele per ciascuno dei 3 plasmidi: il primo compreso Pme I enzima e il secondo senza enzima come controllo.
  2. Precipitare plasmide DNA utilizzando una procedura di etanolo classica e risospendere in 20 ml di H priva di nucleasi 2 O.
  3. Determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro. La concentrazione deve essere superiore a 150 ng / ml per trascrivere cRNA.
  4. Eseguire 1 ml di campioni e loro controlli con 5 ml di tampone di caricamento su un gel di agarosio 0,8% per verificare la linearizzazione plasmide.
  5. Utilizzare un kit per la trascrizione in vitro e cRNA purificazione secondo le istruzioni del produttore. I cRNA trascritte sono risospese in 20 ml di H priva di nucleasi 2 O. I campioni possono essere conservati a -80 ° C, se necessario.
  6. Preparare il tampone di migrazione MOPS 10X contenente 0,2 M MOPS (pH 7.0), 20 mM acetato di sodio e 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilizzare soluzione con un filtro da 0,45 micron. Rifornire la soluzione al riparo dalla luce a temperatura ambiente per evitare l'ossidazione soluzione.
  7. Pulire la vasca di elettroforesi successivamente con NaOH, HCl e accuratamente sciacquati con acqua doppio-filtrata per un O / N per evitare RNasi e prevenire la degradazione dell'RNA.
  8. Cast un gel di agarosio 1,5% contenente MOPS e formaldeide. Caldo fino a completa dissoluzione agarosio e lasciarlo raffreddare a 55 ° C. Sotto cappa, aggiungere 0,1 volume di MOPS 10X, 6,6% di formaldeide e 4 mg di bromuro di etidio (10 mg / ml). Versare il gel sotto la cappa e aspettare circa 1 ora per il gel per indurire.
    Nota: La formaldeide e il bromuro di etidio sono tossici.
  9. Preparare i campioni per la migrazione in un tubo di 0,2 ml di 1 ml di cRNA, 8,8% di formaldeide, il 60% di formammide e 0,1 volume di MOPS 10X. Incubare per 3 min a 70 ° C e mettere i tubi in ghiaccio per 10 min. Centrifugare i campioni pochi secondi a5.000 x g. Aggiungere 2 ml di tampone di caricamento del gel.
    Nota: Formammide è tossico.
  10. Eseguire i campioni per 20 minuti a 90V. Immergere il gel in libera-nucleasi H 2 OO / N per Decolorare il gel prima di analizzarla per verificare la qualità cRNA.
  11. Determinare la concentrazione cRNA utilizzando uno spettrofotometro e conservarli a -80 ° C.

3. Microiniezione di sintesi di RNA e ovociti Maturazione Stimolazione

  1. Preparare le attrezzature necessarie per ovociti microiniezione. Utilizzare un estrattore micropipetta per tirare piccolo capillare di vetro. Sotto stereomicroscopio, rompere l'estremità del capillare con la pinzetta per creare una punta smussata. Riempire la micropipetta capillare con olio minerale con una siringa da 1 ml con un filtro Millipore 0,45 micron all'estremità opposta. Montare la micropipetta sul pipetta microiniezione. Scegli una micropipetta preciso calibrato dal fabbricante per dare una buona precisione se usato con appropriata capillare di vetro.
  2. Eseguire microiniezione 1-2 ore dopo defolliculation, tempo necessario per il recupero degli ovociti su ovociti mantenuta a 14 ° C. Utilizzare piatti di Petri con il fondo raschiato con una pinza per creare una superficie adesiva per ovociti e riempirli con ND96 media.
  3. Disporre ovociti lungo una corsia raschiato in una capsula di Petri permettendo una successiva iniezione di ovociti con micropipetta capillare con un angolo di 45 ° C.
  4. Iniettare nella zona equatoriale ovocita, sotto l'area animale pigmentata per una diffusione ottimale dei campioni nel citoplasma. Inserire solo la parte più sottile di punta capillare su circa 150-200 micron di profondità.
  5. Iniettare 30 ng di cRNA ottenuti rispettivamente dai diversi plasmidi in un volume di 60 nl in una prima ovocita. Dopo l'iniezione, attendere 5-10 secondi prima di rimuovere la punta capillare per evitare la fuga del campione (Figura 2A).
    Nota: non superare i 120 nl. Iniettare più lentamente possibile. Si raccomanda un controllo con acqua distillata.
  6. Spostare manualmente la piastra di Petri per iniettare il prossimo ovocita.
    Nota: Assicurarsi che la punta non sia intasato generando un piccolo impulso dalla soluzione bagno dopo 2 o 3 microiniezioni.
  7. Trasferimento iniettato ovociti in 24 pozzetti piastre di coltura (10 ovociti / pozzetto) riempito con 3 ml di fresco medio ND96 e lasciarli a 19 ° C.
  8. Incubare gli ovociti in ND96 con progesterone (PG) (2 mg / ml) per indurre la maturazione meiotica (GVBD) a 19 ° C, 15 ore o 4 ore dopo la microiniezione di CRNAs poliadenilato ottenuti rispettivamente da pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 e pcDNA6 .2 / C-EmGFP usato come controllo (Figura 2A).
    Nota: Co-iniezione di marcatore fluorescente con il cRNA è uno strumento piacevole di assicurare che il cRNA è stato iniettato e rimase nell'oocita. Effettuare tali esperimenti preliminari con un cRNA di interesse con un tag GFP.
  9. Microinject come in # 3.5 diversi rapporti (1: 3, 2: 2, 3: 1) di poliadenilato eIF4G1-WT e eIF4G1-DN CRNAs per TEst l'effetto cambio di CRNAs eIF4G1-WT sul fenotipo mutante (Figura 2D).

4. Germinal Vesicle Ripartizione Determinazione

  1. Contare il numero di ovociti maturi dopo la stimolazione PG osservando la presenza di una macchia bianca al polo animale nero con uno stereomicroscopio. Ripetere l'contando ogni ora fino alla ventiquattresima ora (Figura 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Analisi

  1. Omogeneizzare il gruppo di 10 oociti mediante movimenti avanti e indietro con una punta micropipetta, a 4 ° C in 200 microlitri nel seguente buffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% SDS, 5 mM MgCl 2, 1 mg / ml di albumina di siero bovino, 10 mg / ml leupeptina, 10 mg / ml aprotinina, 10 mg / ml inibitore di tripsina di soia, 10 mg / ml benzamidine, 1 mM PMSF, 1 mM vanadato di sodio.
  2. Campioni di centrifugazione per 15 min a 10.000 xg per rimuovere il lipide (fase superiore) e la membrana (fase inferiore) fractions. Raccogliere la frazione citoplasmatica, memorizzare un'aliquota di determinare la concentrazione di proteine ​​e completare la restante con Laemmli o un tampone Bis-Tris (1: 1).
    Nota: gel Bis-Tris e tampone di caricamento hanno un pH più neutro che protegge proteine ​​dall'idrolisi
  3. Riscaldare 20 mg di campione a 95 ° C per 10 min. Caricare ciascun campione nei pozzetti del gel di acrilammide. Porre il gel in un serbatoio con tampone appropriato.
  4. Eseguire un elettroforesi per 1 ora a 200 V.
  5. Realizzare un WB in TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, contenente il 10% di albumina sierica bovina) con una capra anti-Aurora A / Eg2 (1: 3.000, 2 ore) o con un anticorpo di coniglio -Aurora A / Eg2-P (1: 1.000, O / N a 4 ° C), topo anti-ERK2 (1: 3.000, 2 ore), di capra anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3.000, 2 ore ), coniglio anti-mos (1: 5.000, 4 ore), coniglio anti-GFP (1: 3.000, 2 ore) antibodies.Use anticorpi murini anti-V5 (1: 10.000, 2 ore) e di coniglio anti-Rsk (1 : 1.000, 2 ore) (come controlli di carico).
  6. lavaggiola membrana 3 volte per 10 min in TBS-Tween e incubare 1 ora sia con un anti-mouse o anti-coniglio o anti-capra (IgM) anticorpo secondario perossidasi di rafano marcata a diluizioni di 1: 5.000, 1: 7.500 e 1 : 5.000 rispettivamente.
  7. Eseguire 3 lavaggi di 10 min in TBS-Tween e rilevare i complessi antigene-anticorpi con il sistema ECL rilevamento avanzato.

6. poliadenilazione Assay

  1. Esempio 5 ovociti per condizione in un 1,5 ml. Lavare con 1 ml di nucleasi PBS 1X (pH 7,4). Le seguenti operazioni saranno effettuate sotto cappa.
  2. Estrarre l'RNA utilizzando una procedura organica classica (vedi istruzioni del produttore).
  3. Recupero RNA mediante centrifugazione (10.000 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aria RNA asciugare per 10 minuti.
  4. Risospendere RNA pellet in 30 ml di H priva di nucleasi 2 O.
  5. Prendere 15 ml di campioni in un nuovo tubo e aggiungere 85 ml di H priva di nucleasi 2 O. Pulire lacampioni sé per migliorare la loro qualità della colonna di silice in base alle istruzioni del produttore. Eluire l'RNA con 30 ml di H priva di nucleasi 2 O
  6. Eseguire 1 ml di campioni con 5 ml di tampone di caricamento su un gel di agarosio 0,8% per controllare l'integrità dell'RNA.
  7. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
  8. Preparare 2 miscele di ligasi per condizione (cioè, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN e il 2 O controllo H) con i seguenti reagenti: 10 U di RNA ligasi, 0,1 volumi di tampone 10X, 1 mM ATP, 10% di PEG8000 50% , 0.1 mg di primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 e portare il volume finale di 10 ml con H priva di nucleasi 2 O. Aggiungere nel primo RNA miscela ottenuta da ovociti senza stimolazione PG e nella seconda RNA miscela ottenuta da PG stimolato oociti.
  9. Incubare per 1 ora a 37 ° C e poi per 20 min a 65 ° C per inattivare l'enzima.
  10. NoiEA cDNA trascrizione inversa (RT) Kit. Preparare l'impasto RT, per provetta: 0,1 volume di tampone 10X RT, 0.1 mg di primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, miscela dNTP 4 mm, 50 U di trascrittasi inversa e completo di nucleasi H 2 O a volume finale di 10 ml. Aggiungere 10 ml di reazione di ligasi ottenuti in precedenza. Eseguire la RT nelle condizioni descritte dal costruttore.
  11. Preparare Polymerase Chain Reaction (PCR) miscela, per provetta: 0,1 volume di tampone 10X, 1,5 mM MgCl 2, 133 micron miscela dNTP, 0,2 micron specifico fondo, 0,2 micron di primer P2, 0.025 U Taq polimerasi, 1 ml di cDNA e completo di priva di nucleasi H 2 O al volume finale di 50 ml. Eseguire la PCR nelle seguenti condizioni: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 10 min, [95 ° C per 1 min, 56 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec] * 40 cicli, 72 ° C per 10 min 9. I primer specifici sono i seguenti: mos, GB4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA istoni-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; La ciclina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
  12. Preparare un gel di agarosio al 3%. Aggiungere in ogni PCR prodotti 10 ml di tampone di caricamento. Eseguire il gel con 10 ml di campioni a 110 V per una migrazione ottimale. Analizzare il gel dopo 10 e 20 minuti per osservare un cambiamento di dimensione che riflette la lunghezza della coda di poli (A) e quindi la maturazione RNA che è un prerequisito per la loro traduzione.

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Risultati

La maturazione degli ovociti di Xenopus cinetica e la determinazione della percentuale di GVBD ovocita dopo 24 ore di stimolazione PG (Figure 2B, 2C):

Al fine di studiare le conseguenze di traslazione della mutazione eIF4G1-DN, la risposta alla PG in Xenopus laevis ovociti microiniettati con cRNA eIF4G1-DN viene confrontato con eIF4G1-WT e ad altre condizioni di controllo (H 2 O, GFP). I controlli consentono di valutare l'incidenza di ovociti...

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Discussione

La traduzione è un meccanismo coinvolto nella fisiopatologia di numerose patologie umane, tra cui diverse malattie neurodegenerative. Per esempio nella malattia di Parkinson diversi rapporti hanno suggerito la riduzione di valore in traduzione associata a mutazioni ereditarie 8,12,13.

Diversi modelli cellulari sono a disposizione per lo studio di traduzione. Qui, al fine di studiare gli effetti traduzionali di una mutazione in eIF4G1 che agisce come dominante negativo mutazione ri...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata da INSERM, Università di Lille 1, Università di Lille 2, Centro Ospedaliero Regionale di Lille (CHR de Lille). MCCH riconosce il sostegno della Fondation de France e desidera ringraziare l'IRCL, il Prof. Sonenberg per il dono dei plasmidi V5, il Dr. Dissous (Istituto Pasteur, Lille) per il dono degli anticorpi anti-GFP, l'UMS 3387 (Università di Rennes) dove vengono acquistati gli ovociti di Xenopus e il Dr. Taymans (JPArc, Lille) per la lettura critica del testo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tricaina metano solfonatoSandozMS-222manipolazione ovociti
PinzeMoriaDumont MC40
Streptomicina/penicillinaSigma781
Piruvato di sodioSigmaP2256
Inibitore della tripsina di soiaSigmaT9128
TetraciclinaSigmaT7660
Filo Vicryl riassorbibile per veterinarioJohnson& Johson IntlJV1205
Collagenasi ARoche diagnostica10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SPreparazione di mRNA sintetico
senza DNAsi/RNAsi H2OLife Technologies10977
Acetato di sodioMerck6268
Etanolo assolutoSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Bromuro di etidio 10 mg/mlLife Technologies15585-011
mMESSAGGIO mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
Formaldeide 37%Merck1.04003.1000
FormamideFluka47671
Gel Doc ImagerBiorad
Pipetta per ovociti con 100 capillari in vetro da 8Microiniezione
Drummond Scientific Company 3-000-510-XVetro di ricambio 8"Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0.45 µ m filtroMilliporeSLHA025NB
ProgesteroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Albumina sierica bovinaSigmaA4612
lepupeptinSigmaL8511
aprotininaSigmaA1153
benzamidinaSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
sodio vanadatoSigmaS6508
tampone LaemmliBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Gel proteici Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pozzettiLife TechnologiesNP0323BOX
l'elettroforesi SDS-PAGE, mini-proteiforme TGXBiorad456-1036 e -1096
sistema orizzontale semi-dry blottingW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL MembraneAmersham Life Science10401180
MetanoloVWR20846-292
Ponceau Rosso (0,5%)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Santa Cruz Biotechnologysc-27884
anti-Eg2-PCell SignalingC39D8
anti-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anti-RskSanta Cruz Biotechnologysc-231
anti-mosSanta Cruz Biotechnologysc-86
anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano anti-topoSanta Cruz Biotechnologysc-2005
anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano di coniglioSanta Cruz Biotechnologysc-2812
anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano di capraSanta Cruz Biotechnologysc-2378
Sistemaavanzato di rilevamento ECLAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417test di poliadenilazione
TRIZOL (reagente di lisi Qiazol)Qiagen79306
cloroformioSigma31998-8
IsopropanoloSigma278475-1L
RNeasy mini kitQiagen74106
RTL tampone Qiagen79216
Set di DNAse libero da RNAsiQiagen79254
PrimerEurogentec
T4 RNA ligasi 1 New England BiolabsM0204S
Kit di trascrizione inversa c-DNA ad alta capacitàApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Taq polimerasiLife Technologies10342020
"

Riferimenti

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