Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sommario

Abbiamo sviluppato una preparazione gene-chimerica del circuito ventrale ippocampale – accumbens in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare i meccanismi presinaptici della trasmissione sinaptica mediata dai recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR). Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica.

Abstract

Il miglioramento sostenuto della segnalazione assonale e l'aumento del rilascio di neurotrasmettitori attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici pre-sinaptici dell'acetilcolina (nAChR) è un importante meccanismo per la neuromodulazione da parte dell'acetilcolina (ACh). La difficoltà di sondare i meccanismi di segnalazione all'interno degli assoni intatti e alle terminazioni nervose sia in vitro che in vivo ha limitato i progressi nello studio delle componenti presinaptiche della plasticità sinaptica. Qui introduciamo una preparazione gene-chimerica del circuito dell'ippocampo ventrale (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare sia le componenti pre- che post-sinaptiche della trasmissione, variando selettivamente il profilo genetico dei neuroni pre- vs post-sinaptici. Dimostriamo che le proiezioni delle microfette di vHipp, come input assonale pre-sinaptico, formano sinapsi glutammatergiche multiple e affidabili con bersagli post-sinaptici, i neuroni dispersi dal nAcc. La localizzazione pre-sinaptica di vari sottotipi di nAChR viene rilevata e la trasmissione sinaptica mediata dal segnale nicotinico pre-sinaptico viene monitorata mediante registrazione elettrofisiologica concomitante e imaging di cellule vive. Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica glutammatergica in vitro.

Introduzione

Modulazione colinergica circuito eccitabilità contribuisce ad aspetti fondamentali della cognizione, e modulazione colinergici alterato è una caratteristica di malattie neurodegenerative e neuropsichiatrici tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la dipendenza ^1-4. Un meccanismo stabilito di facilitazione colinergici della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale è attraverso l'attivazione diretta di nAChR localizzati nei siti pre-sinaptici. L'attivazione di questi recettori presinaptici porta ad un aumento intracellulare Ca ²⁺ ([Ca ^2+] _i) nei terminali presinaptici - sia direttamente, a causa della relativamente alta conduttanza di calcio di alcuni sottotipi di nAChR, e indirettamente, tramite intracellulari cascate di segnalazione ^5, rafforzando in tal modo il rilascio di neurotrasmettitore. Infatti, l'attivazione del nAChR pre-sinaptici è stato collegato con i cambiamenti nel rilascio di un'ampia varietà di neurotrasmettitori compresi glutammato, GABA, ACh, unnd dopamina ^6-10. Sebbene questo processo è stato studiato indirettamente utilizzando metodi elettrofisiologici a vari sinapsi, reporter ottiche di [Ca ^2+] _i e riciclo delle vescicole sinaptiche permettono misura più diretta e temporalmente precisa dei fenomeni pre-sinaptici.

Localizzazione pre-sinaptica dei nAChR è stata dimostrata in modo convincente con etichettatura immuno-oro diretto della nAChR al microscopio elettronico (EM) il livello ^11,12. Diverse altre tecniche sono state utilizzate anche per affrontare la localizzazione nAChR indirettamente, anche rilevando posizioni di nAChRs subunit- fluorescenti chimere proteine ​​in neuroni in coltura ^13,14, registrazione elettrofisiologica delle correnti nAChR nei terminali sinaptici ^15,16, il monitoraggio nicotina indotto cambiamenti in [Ca ^{2 +]} _i in terminazioni nervose sinaptiche di immagini dal vivo delle cellule ^17, e monitoraggio indiretto del rilascio di neurotrasmettitore al terminale sinaptico datecniche di imaging cellulare dal vivo con indicatori fluorescenti, tra cui esocitosi delle vescicole sinaptiche visti da stirilici coloranti anfipatiche FM (FM1-43 e FM4-64) e / o Synapto-pHluorin e da specifici neurotrasmettitori reporter fluorescenti, come CNiFERs per ACh e iGluSnFr per il glutammato ^18-20. Nel complesso, questi approcci attuali per identificare la localizzazione pre-sinaptica di nAChR sono complicate e richiedono sistemi e tecniche speciali per permettere l'identificazione affidabile e monitoraggio fisiologico di attività pre-sinaptica.

Qui si descrive protocolli e attrezzature per un sistema di co-coltura in vitro di un ippocampo ventrale (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) circuito che fornisce accesso diretto a identificare e analizzare i due componenti pre e post-sinaptici della trasmissione sinaptica. Mostriamo esempi di localizzazione pre-sinaptica di nAChR e imaging cellulare dal vivo di nAChR mediata Ca ²⁺ di segnalazione e di rilascio dei neurotrasmettitori aloassoni ng vHipp. Una naturale estensione (e semplice) del protocollo presentato qui è la preparazione di contatti pre e post-sinaptiche composti da neuroni provenienti da diversi genotipi. In questo modo il contributo di un particolare prodotto genico al pre e / o meccanismi di post-sinaptici di modulazione può essere valutata direttamente.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Publications No. 80-23, riveduta 2012) e gli studi sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Uso delle commissioni di ricerca alla Stony Brook University (# 1618 e # 1792).

1. vHipp-NACC sinaptiche co-culture

1. Topi Sacrifice (postnatale giorno 0-3, da wild-type (WT) o nAChR α7 linea di topo transgenico) con emissioni di CO _2. Decapitare ogni cucciolo e salvare la coda in una provetta da 1,5 ml centrifugare per post facto genotipizzazione. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile.
2. Togliere la parte superiore del cranio con le forbici e pinze per esporre tutto il cervello. Partendo dalla congiunzione dove le cortecce cerebrali parte una dall'altra caudalmente, ottenere una sezione coronale che contiene le cortecce posteriori che includono la vHipp ^5,21 sotto un microscopio da dissezione.
3. Sezionare vStrisce di tessuto Hipp contenenti regione CA1-subiculum secondo un atlante sviluppo cerebrale del mouse ²² (Figura 1A). Trasferimento a un piatto di coltura 35 millimetri contenente terreni di coltura freddo (4 ° C), tagliato a fettine sottili (circa 100 micron × 100 micron microslices).
4. Pre-incubazione 12 millimetri poli-D-lisina / vetrini laminina rivestite all'interno di 24 pozzetti di coltura tissutale con terreni di coltura (~ 500 microlitri) per almeno 30 minuti in incubatrice a 37 ° C. Rimuovere i supporti prima di placcatura microslices.
5. Piatto con una pipetta Pasteur lucidati a fuoco al centro del vetrino con minima quantità di supporti (~ 50 microlitri, contenente ~ 20 pezzi di microslices) per facilitare il fissaggio degli espianti. Piatto microslices vHipp provenienti da un singolo animale (sia il + / + o il - / - genotipo della linea α7 transgenica) su ogni vetrino.
6. Dopo gli espianti depositano sul vetrino, aggiungere delicatamente multimediale aggiuntivo (~ 100 ml) di the parete in modo che il livello dei media è sufficientemente alto per coprire completamente le espianti sulla periferia, ma non quelli al centro del vetrino.
7. Dopo un / N incubazione O a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore, disperdere i neuroni NACC da giorni embrionali 18 di post-natale giorno 1 topi WT e aggiungere gli espianti.
   1. Sezionare tessuti NACC secondo un sviluppo atlante cervello di topo ²⁰ (Figura 1B).
   2. Tagliare a piccoli pezzi (circa 500 micron × 500 micron microslices) e trasferimento in una provetta da 15 ml.
   3. Trattare con 0,25% tripsina (2 ml) per 15 min a 37 ° C. Lavare pezzi di tessuto tre volte con mezzi di lavaggio a freddo (5 ml, 4 ° C) seguito da un lavaggio in mezzi di coltura fredda (5 ml, 4 ° C). Lasciare riposare la sospensione per 5 minuti in ogni fase di lavaggio, e poi versare con cautela il surnatante.
   4. Separa celle di dolce triturazione in 2 ml di coltura con un leggermente incendio lucidato pipetta Pasteur.
   5. Transsospensione cellulare fer ad un'altra provetta da 15 ml e centrifugare a 2.000 x rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in coltura a 1 ml per 6 cuccioli. Disperdere le cellule pipettando delicatamente in mezzi più volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur.
   6. Aggiungere 0,25 ml di cellule NACC dispersi ad ogni vetrino con espianti vHipp.
   7. Mantenere le culture in un umidificata 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Mettere piastre di coltura su inumidite garze sterili per stabilizzare meccanicamente e mantenere l'umidità, favorendo la formazione di sinapsi.

2. Immunocitochimica

1. Fissare culture (5-7 giorni in vitro) nel 4% paraformaldeide / 4% di saccarosio / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 20 min, RT).
2. Culture permeabilize con 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 5 min, RT).
3. Culture di blocco con il 10% di siero asino normale in PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 30 min, RT) prima gli anticorpiy colorazione. Incubare con anticorpi primari O / N a 4 ° C. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: nAChRs anti- (α ₄ -ECD 1: 500; anti-α ₅ subunità, 1: 500), anti-vescicolare trasportatore del glutammato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
4. Lavare anticorpi primari con PBS (3 volte / ~ 500 microlitri per vetrino, 5 min) e poi incubare culture anticorpi secondari coniugati Alexa 488 (~ 500 ml per vetrino, 1: 500) o Alexa 594 (~ 500 microlitri per coprioggetto , 1: 500) per 1 ora a 37 ° C.
5. Incubare culture in αBgTx coniugati Alexa 594 (~ 500 ml per vetrino, 1: 1.000 in coltura) per 45 minuti a 37 ° C prima della fissazione per l'etichettatura superficie α7 * nAChR.
6. Inserire e tenuta coprioggetto.
7. Catturare le immagini con un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivi Plan-Apocromatici (20X con 0,8 NA o 63X olio con 1.4 NA) e una fotocamera CCD.

3. FM1-43 Based vescicolare Fusion

1. Mantenere culture (5-7 giorni in vitro) in un camera di imaging, montare la camera su disco rotante microscopio confocale. Continuously profumato (1 ml / min) con HBS cocktail RT.
2. Smettere di culture di perfusione e di carico con 10 micron FM1-43 in 56 mm K ⁺ ACSF (~ 500 microlitri) per 90 secondi (colorazione), lavare tintura esterno via per 15 minuti con Ca2 ⁺ HBS gratuito contenente ADVASEP-7 (0,1 mm) per pulire FM1-43 legato alla membrana.
3. Stimolare le culture con 56 mm K ⁺ ACSF (~ 500 microlitri) senza FM1-43 per 120 sec (decolorazione), ricaricare le culture con FM1-43 utilizzando le stesse condizioni, e lavare di nuovo con Ca2 ⁺ HBS gratuito contenente ADVASEP-7 per 15 min.
4. Acquisire FM1-43 immagini a fluorescenza con disco rotante microscopio confocale equipaggiato con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e catturare immagini con una telecamera CCD.
5. Raccogliere immagini FM1-43 fluorescenza di base (ogni 2 s per 1 min) Il controllo pre-nicotina; applicare nicotina (1 mM) di perfusione rapida (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l'applicazione di nicotina ogni 2 secondi per 5 min.
6. Quantificare FM1-43 intensità di fluorescenza prima (F _colorazione) e dopo (F _decolorante) applicazione nicotina ad ogni bouton sinaptica.
7. Calcola importo complessivo di rilasciabile fluorescenza FM1-43 lungo gli assoni vHipp quantificando la differenza di FM1-43 fluorescenza prima e dopo l'applicazione della nicotina (Af = F _colorazione -F _{decolorazione).} Analizzare frazione della diminuzione dell'intensità di fluorescenza dopo nicotina con la seguente equazione: _diminuzione F% = Af / F _colorazione.

4. Imaging di calcio

1. Sciacquare culture (5-7 giorni in vitro) rapidamente con normale HBS, quindi caricare le culture con 5 Indicatore mM Fluo-4 Ca ²⁺ (AM estere) e 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) per 30 min a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Lavare Fluo-4 soluzione HBS (3 volte / 5 min). Culture Ritorno a incubatore (37 ° C / 5% di CO ₂₎ per almeno 30 minuti.
3. Mantenere le culture nella stessa camera di imaging e stesse condizioni descritte nella sezione FM1-43 fusione vescicolare base (vedi punto 3.1).
4. Raccogliere le immagini Fluo-4 di fluorescenza di proiezioni assonale dai vHipp micro-fette con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e una fotocamera CCD.
5. Raccogliere basali Fluo-4 fluorescenza (ogni 10 sec per 2 min) il controllo pre-nicotina, applicare nicotina (1 micron) di perfusione rapido (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l'applicazione di nicotina ogni 10 sec per 30 min.
6. Salvare tutti i fotogrammi dei fluo-4 fluorescenza prime, l'esportazione come una serie diLe immagini in formato TIFF per ulteriori analisi.
7. Raccogliere l'intensità integrata di fluo-4 fluorescenza lungo gli assoni vHipp prima e dopo l'applicazione di nicotina.
8. Normalizzare intensità di fluorescenza integrato con la seguente equazione: Af / F ₀ = ₍₀ FF) / F _0, dove F ₀ è il pre-nicotina intensità di fluorescenza integrato fondo corretto e F è l'intensità di fluorescenza integrato lungo gli assoni vHipp ad ogni tempo dopo l'applicazione di nicotina. Analizzare e tracciare normalizzato intensità di fluorescenza integrato.

Risultati

La preparazione impiegato consiste gene chimerico co-colture di circuiti vHipp-NACC in vitro. Le proiezioni provenienti da microslices vHipp, come input assonale pre-sinaptica, possono prendere contatti sinaptici con obiettivi post-sinaptici, i neuroni dispersi da NACC. La nicotina ha indotto una sostenuta (≥ 30 min) la facilitazione della trasmissione glutammatergica dai neuroni NACC innervati dal vHipp assoni ²¹ e prolungata di calcio di segnalazione lungo gli assoni vHipp ⁵ via α7 pre-s...

Discussione

La preparazione co-coltura descritto ri-capitola ventrale circuiti dell'ippocampo-accumbens in vitro. Questo esame permette di preparazione relativamente semplice e affidabile dei profili spazio-temporali per cui l'attivazione di nAChR pre-sinaptici suscitare esaltata trasmissione glutamatergica ^{5, 21.}

Co-colture sono definite come la crescita di diversi tipi cellulari specifici in un piatto che può fornire condizioni fisiologiche in vitro per dimostrare ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. Terreni di coltura (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
Integratori B-27	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillina-Streptomicina	GIBCO	10908-010	0,5 ml
GlutaMAX Integratore	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. mezzi di lavaggio (HBSS, 100 ml)
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo.	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. Soluzione salina tamponata HEPES  (HBS)    pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosio	Sigma	G0350500	10 mM
4. Cocktail HBS per imaging dal vivo pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosio	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotossina	Tocris	1078	2 µ M
bicucullina	Tocris	131	10 µ M
D-AP-5	Tocris	105	50 µ M
CNQX	Tocris	1045	20 µ M
LY341495	Tocris	1209	10 µ M
5. Senza calcio  HBS    pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosio	Sigma	G0350500	10 mM
6. 56 mM Potassio ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucosio	Sigma	G0350500	10 mM