Le proprietà meccaniche e microstruttura della matrice extracellulare influenzano fortemente la migrazione delle cellule 3D. Un metodo in vitro per studiare il comportamento di migrazione delle cellule spazio-temporale in ambienti biofisico variabili, sia a livello della popolazione e delle singole celle, è descritto.
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Articolo metodologico
Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità delle cellule di migrare è cruciale in un'ampia varietà di funzioni cellulari per tutta la vita di sviluppo embrionale e la guarigione della ferita al tumore e metastasi. Nonostante intensi sforzi di ricerca, i principi biochimici e biofisici fondamentali della migrazione cellulare non sono ancora pienamente compresi, soprattutto nelle fisiologicamente rilevanti (3D) microambienti tridimensionali. Qui, descriviamo un test in vitro per permettere l'esame quantitativo di comportamenti di migrazione delle cellule in 3D. Il metodo sfrutta la capacità mechanosensing della cellula e propensione a migrare nella matrice extracellulare precedentemente occupato (ECM). Usiamo l'invasione delle cellule del cancro al seno altamente invasivo, MDA-MB-231, in gel di collagene come sistema modello. La diffusione della popolazione cellulare e le dinamiche di migrazione delle singole cellule nel corso di settimane della cultura possono essere monitorati tramite live-cell imaging e analizzati per estrarre i dati spatiotemporally-risolti. Inoltre, Il metodo è facilmente adattabile per diverse matrici extracellulari, offrendo così un modo semplice ma potente per studiare il ruolo dei fattori biofisici del microambiente sulla migrazione delle cellule.
Introduzione
La migrazione di cellule svolge un ruolo chiave nella varie risposte fisiologiche quali lo sviluppo embrionale, emostasi, e la risposta immunitaria, nonché in processi patologici come le malattie vascolari, infiammazione e cancro 1. Analisi dei fattori biochimici e biofisici sottostanti migrazione delle cellule è quindi di fondamentale importanza non solo per capire i principi fondamentali di funzioni cellulari, ma anche per avanzare varie applicazioni biomediche, come in ingegneria tissutale, anti-metastasi e sviluppo anti-infiammatori droga. Poiché osservazione in vivo è tecnicamente difficile, molti sforzi si è focalizzata sulla ricapitolazione....
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Protocollo
Raccolta 1. Cella
- Ottenere MD-MBA-231 cellule dal 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Staccare le cellule dal tessuto piastra di coltura con 0,5% di soluzione di tripsina-EDTA. Usare 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA per cellule coltivate in un pallone T25.
- Cellule pellet in un tubo da 15 ml per centrifugazione a 200 g per 4 minuti, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 ml di coltura.
- Conte densità cellulare, ρ, utilizzando un emocitometro.
Nota: Per preparare il gel interno delle cellule testa di serie, la sospensione cellulare viene successivamente diluito 10 × per raggiungere la finale densità di....
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Risultati
Il test gel concentrica qui presentato è stata effettuata utilizzando cellule di carcinoma mammario altamente invasive, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml di gel di collagene interna e una densità di semina cellulare di = 2 × 10 6 cellule / ml, come esempio. Come mostrato in Figura 2, tipicamente dopo alcuni giorni di coltura, le cellule violato l'interfaccia gel interno-esterno e ha iniziato ad invadere il gel esterno. La popolazione di cellule diffuse prevalentemente radialmente verso l'es.......
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Discussione
In questo protocollo descriviamo un saggio in vitro per studiare il comportamento migratorio 3D di cellule in ambienti di matrice che assomigliano topologicamente alle ECM incontrate in vivo. Ci sono tre punti di forza principali di questo test rispetto ad altri metodi attualmente disponibili. In primo luogo, questo test consente di esaminare simultaneamente i meccanismi di migrazione cellulare sia a livello di popolazione che a livello di singola cellula. Ciò apre la possibilità di studiare la migrazio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano W. Sun e K. Jansen per le discussioni critiche, e per il sostegno da parte del Nano Biomeccanica Lab presso l'Università Nazionale di Singapore. NAK riconosce il sostegno di una Marie Curie IIF Fellowship.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatore per colture cellulari | Fisher Scientific Pte Ltd | Modello: 371, S/No 318854-6055 | |
| Microscopio confocale | Nikon A1R | Microscopio a scansione laser confocale invertito dotato di camera di incubazione | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Colorante fluorescente CellTracker CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Piatto con fondo in vetro | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | Piatto da 35 mm di diametro con pozzetto con fondo in vetro da 12 mm |
| di diametro Emocitometro | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Migliorato) | |
| PHmetro a microprocessore | Hanna | Instruments pH 211 | |
| Nutragen Collagene | Advanced BioMatrix | #5010-D | Collagene bovino solubilizzato in acido di tipo I (pH stock ~ 2) |
| Obiettivo | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8,2-6,9 mm, NA 0,45. | |
| Penicillina-Streptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Misuratore di pH | Sartorius | S/No 29153352 | Misuratore di pH basico PB-11 |
| Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
Riferimenti
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. ....
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Ristampe e permessi
