Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

Summary

Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Abstract

C'è attualmente un notevole interesse nel capire come le cellule e i tessuti rispondono agli stimoli meccanici, ma gli approcci attuali sono limitati nella loro capacità di misurare le risposte in tempo reale in cellule vive o tessuti vitali. È stato sviluppato un protocollo con l'uso di un attuatore cellulare per distendere le cellule vive cresciute o i tessuti attaccati a un substrato elastico durante l'imaging con microscopia confocale e a forza atomica (AFM). Studi preliminari dimostrano che lo stretching tonico delle cellule epiteliali bronchiali umane ha causato un aumento significativo della produzione di superossido mitocondriale. Inoltre, utilizzando questo protocollo, le cellule epiteliali alveolari sono state allungate e sottoposte a immagini, il che ha mostrato un danno diretto alle cellule epiteliali per sovradistensione, simulando una forma di lesione polmonare in vitro. Viene inoltre fornito un protocollo per condurre la nano-indentazione AFM su celle allungate.

Introduction

Le cellule sono sottoposte a sollecitazioni meccaniche in molti tessuti, e questa stimolazione meccanica ha dimostrato di promuovere cambiamenti nei modelli di espressione genica, il rilascio di fattori di crescita, citochine, o rimodellamento della matrice extracellulare e citoscheletro ^1-4. I segnali intracellulari trasdotte da tali stimoli meccanici avvengono attraverso il processo di meccanotrasduzione ^5-7. Nel sistema respiratorio, un risultato di mechanotransduction è l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) ^8,9 e citochine pro-infiammatorie ¹⁰ in cellule epiteliali polmonari in presenza di deformazione a trazione ciclica. Forte evidenza suggerisce anche che un'eccessiva deformazione a trazione porta a dirigere ferita all'epitelio alveolare, oltre alle risposte biochimiche delle cellule ^11-14. Anche se il fuoco qui è soprattutto sulla risposta delle cellule polmonari a deformazione meccanica, percorsi indotte da meccanotrasduzione svolgono un ruolo chiave nei basic funzione di molti tessuti del corpo umano, compresa la regolazione del tono vascolare ¹⁵ e lo sviluppo della piastra di crescita ^16.

Il crescente interesse meccanotrasduzione ha portato allo sviluppo di numerosi dispositivi per l'applicazione di fisiologicamente rilevanti sollecitazioni meccaniche alle cellule in coltura e tessuti. In particolare, i dispositivi che applicano lo sforzo a trazione, che è una forma comune di carico meccanico sperimentato da tessuto, sono popolari ^11,17-19. Tuttavia, molti dei dispositivi disponibili sono sia concepita come un bioreattore per applicazioni di ingegneria tissutale o non sono favorevoli a delle immagini in tempo reale con la stirata. In quanto tale, vi è la necessità di sviluppare strumenti e metodi in grado di visualizzare le cellule e tessuti in tensione per facilitare la ricerca di percorsi di meccanotrasduzione.

Qui, un dispositivo che si estende in piano meccanico è stato progettato e sono stati sviluppati protocolli per applicare mforme ultiple di tensione ai tessuti e cellule pur consentendo l'imaging delle risposte biochimiche e meccaniche in tempo reale (Figura 1A-D). Il dispositivo utilizza sei morsetti equidistanti disposte circonferenzialmente ad afferrare una membrana flessibile e applicare una in piano, radiale distensione fino a circa il 20% (Figura 1B). Il dispositivo di azionamento può essere collocato in un incubatore di coltura cellulare per un periodo di tempo prolungato, mentre il motore (Figura 1C) è posizionato all'esterno dell'incubatrice e controllato da software proprietario fornito dal fornitore del motore. Il motore è collegato ad un driver lineare, che fa ruotare una camma interna, guidando i sei morsetti barella uniformemente in tensione e rilassamento.

Oltre al dispositivo meccanico, membrane flessibili personalizzati sono stati creati da commercialmente disponibili coltura cellulare membrane pronti per essere utilizzati nel sistema meccanico. Poi pareti circolari (con un diametro di circa28 mm) sono state fatte e attaccato alla membrana flessibile in modo che le cellule possono essere coltivate solo in questa regione del profilo ceppo ben descritto. Al fine di determinare se il posizionamento di queste membrane all'interno del dispositivo di azionamento fornirebbe una sollecitazione uniforme e isotropo nel centro della membrana flessibile, analisi agli elementi finiti è stata condotta utilizzando software disponibile in commercio (Figura 1E-F). La membrana flessibile è stato modellato con condizioni al contorno simmetriche e utilizzando tutti gli elementi quadrangolari per la maglia. Gli anelli concentrici visto nella trama di contorno di massima deformazione principale mostrato nella Figura 1F indicano la distribuzione isotropa del ceppo.

Il ceppo sperimentato dalla membrana è stata misurata registrando immagini marcature attraverso carico (Figura 2). Figura 2D mostra che la deformazione media membrana misurata in direzioni radiali e assiali era approssimativamente linearerispetto al motore applicata conta fino a un ceppo lineare massima di 20%. Non c'era alcuna differenza significativa tra i livelli di deformazione misurati durante distensione rispetto a quelli misurati durante la retrazione nella posizione di riposo. Successivamente, lo spostamento di cellule umane bronchiali epiteliali (16HBE) e loro nuclei coltivate sulla membrana flessibile personalizzato sono stati misurati. Fluorescente (DAPI) nuclei delle cellule 16HBE sono stati ripresi utilizzando un obiettivo 20X al microscopio confocale, mentre lo spostamento a cellula intera è stata misurata con le immagini registrate contrasto di fase con un microscopio digitale. Come si vede in figura 3, la deformazione misurato dallo spostamento dei nuclei era simile a quello misurato per spostamento di marcature sulla membrana, fino a ~ 20% di deformazione lineare. Ciò conferma che il ceppo applicato alle membrane è stata trasmessa alle cellule aderenti. I protocolli che descrivono l'uso del dispositivo personalizzato su un microscopio tradizionale e una forza microscop atomicae sono previste nei seguenti passi.

Protocol

1. Costruzione di membrana con Well Mura per la conservazione di cellule di coltura (vedi Figura 1D per il prodotto finale)

1. Utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) fogli rivestiti con collagene I, tagliare il contorno della membrana flessibile con un bisturi o un dado.
2. Posizionare ogni membrana in una piastra di Petri di 60 mm per immagazzinaggio.
3. Creazione di pareti:
   1. Mescolare PDMS in un rapporto di 10: 1 in peso di elastomero A a elastomero B (induritore).
   2. Versare 5 ml di PDMS completamente misti in provette da 50 ml.
   3. Mettere 50 ml tubi con PDMS TDS orizzontalmente in un fornetto.
   4. Utilizzare la funzione del rotore per rivestire le pareti interne dei tubi a 8 rpm durante il tempo di polimerizzazione. A RT, i PDMS saranno perfettamente polimerizzato in 2 giorni.
   5. Rimuovere il PDMS dal tubo in una cappa sterile coltura cellulare.
   6. Utilizzando una nuova lama di rasoio, partizionare il cilindro di PDMS in sezioni 4 millimetri di altezza.
   7. Posizionare le sezioni, che servirà come il wa membranalls, in un contenitore piatto Petri senza consentire alle pareti diventino creased.
4. Selezionare e centrare una parete di PDMS su una membrana, mantenendo i due nella scatola di Petri.
5. Posizionare delicatamente PDMS TDS (10: 1 ratio) sul perimetro esterno della parete da utilizzare come collante. Evitare la formazione di spazi vuoti tra la parete e la membrana essendo lì per trattenere liquidi.
6. Inserire ogni piatto Petri contenente la membrana completato e coperto in stufa a 70 ° C per 24 ore per curare.

2. Correlazione di giri del motore con morsetto Spostamento o crescita radiale per la calibrazione (Figura 2)

1. Avviare il software di controllo del motore.
2. Spostare i morsetti del dispositivo utilizzando l'impostazione manuale del software del motore.
3. Misurare la distanza e registrare la posizione di conteggio del motore tra opposte morsetti sia cilindrata minima e massima delle pinze.
4. Calcolare la variazione percentuale distance fra le ganasce in funzione del conteggio motore (~ 0-75k conteggi). Ciò indica la deformazione massima potenziale raggiunto sulla membrana.

3. Applicazione di Stretch su Cell Line polmone mouse epiteliale (MLE12)

1. Seed MLE12 cellule a 2,5 milioni di cellule sulla membrana flessibile (Fase 1) per pozzetto da confluenti entro due giorni. La densità di semina può variare per diversi tipi di cellule.
2. Assicurarsi che l'attuatore meccanico è in una posizione completamente rilassato.
   1. Rimuovere cellule di coltura.
   2. Utilizzando 1,5 millimetri punzoni biopsia, perforare due fori in ciascuna delle sei morsetto (vedi Figura 1D) linguette della membrana. Il posizionamento radiale dei fori determina la quantità di pre-tensionamento esperienze membrana inizialmente. Perforare i fori ad un raggio di 20,5 mm sulle linguette membrana se non pretensionamento è desiderato.
   3. Posizionare la membrana sulla barella con i fori punzonati allineando i perni nei morsetti.Primo posto morsetti a posto. Serrare le viti una alla volta alternando i lati.
   4. Aggiungere 1 ml terreni di coltura delle cellule.
3. Posizionare il dispositivo sul palco microscopio centraggio mezzo della membrana con il percorso ottico.
4. Utilizzare nastro o magneti (se possibile) per fissare il dispositivo alla fase. Una volta fissato, il controllo in-plane (parallela alla membrana) e verticale (direzione z) del dispositivo meccanico con il controllore del microscopio.
5. Applicare stirata con il software fornito dal produttore controllando manualmente la posizione e la velocità di rotazione del motore ^20.

4. Misura di mitocondriali specie reattive dell'ossigeno (ROS)

1. Una volta che le cellule sono confluenti, aggiungere 1-2 ml di RT DMEM con indicatore superossido mitocondriale (5 mM concentrazione finale) direttamente sulle cellule.
2. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
3. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con tampone riscaldato a bagnomaria per37 ° C.
4. Porre immediatamente la membrana flessibile sulla barella (Step 2.2) già in atto con un microscopio confocale in posizione verticale.
5. Aggiungere 1 ml di DMEM con terreno privo di fenolo-rosso e 25 mm di HEPES.
6. Impostare filtri di eccitazione / emissione di 510/580 nm.
7. Immagine più campi ogni 15 minuti per creare il decorso temporale desiderato di produzione di superossido mitocondriale.
8. Dalle immagini catturate, intensità della fluorescenza registrare istogrammi ad ogni intervallo di tempo utilizzando il software in grado di quantificare l'intensità di fluorescenza.

5. Applicazione di Stretch e microscopia a forza atomica (AFM)

NOTA: Questi passaggi sono previsti per un AFM combinazione specifica microscopio ottico (figura 4 e Materiali List).

1. Preparare la AFM per l'esperimento.
   1. Aumentare l'altezza della testa AFM alla sua posizione massima nella direzione z.
   2. Mettere estensori sulle gambe della AFM persollevare il piano a cui sbalzo contatti AFM il campione. Il campione e la testa AFM deve essere sollevato per ospitare l'altezza del dispositivo meccanico.
2. Preparare il microscopio ottico (se disponibile).
   1. Rimuovere la piastra di scansione AFM. Rimuovere l'obiettivo desiderato.
   2. Aggiungi un distanziatore all'obiettivo. L'altezza del distanziatore dipenderebbe l'obiettivo e l'AFM specifico set-up, ma è necessario se imaging ottico è desiderata dal piano di osservazione sarà spostamento nella direzione z di una quantità pari alla barella e altezza adattatore (Figura 5A). Si noti che la AFM fornisce solitamente basso ingrandimento delle immagini da un percorso ottico sul dispositivo.
   3. Montare la parte posteriore obiettivo desiderato nella sua posizione. Posizionare lo scanner al AFM.
   4. Avviare il software AFM. Avviare tutte le sorgenti luminose necessari tra cui la sorgente luminosa per misure di fluorescenza.
   5. Montare un chip con una trave a sbalzo cheè opportuno che le misure desiderate. 200 pN / rigidità nm o inferiore è preferibile quando si misura il modulo elastico di cellule vive.
   6. Allineare il laser e calibrare la rigidità sbalzo secondo le indicazioni del fabbricante su un vetrino di vetro montato sul dispositivo.
3. Preparare una membrana, come nella fase 1, ma con le seguenti modifiche.
   1. Immediatamente prima di montare la membrana al dispositivo tenditore, tagliare le pareti di circa 1 mm di altezza. Questo impedisce l'interferenza sperimentato tra le pareti della membrana e la cella di carico.
   2. Montare la membrana sul dispositivo meccanico come descritto 3.2.1-3.2.3.
   3. Rimuovere terreni di coltura cellulare per evitare danni allo scanner AFM in caso di fuoriuscita.
   4. Coppia il dispositivo con un adattatore (Figura 5A). Posizionare il dispositivo meccanico con l'adattatore sullo scanner.
   5. Allungare la membrana per il livello di deformazione a trazione desiderato.
4. Nano-indentazione di cellule allungate.
   1. Aggiungere un numero limitato (<0,5 ml) il volume dei media sulle cellule per evitare scanner AFM o danni microscopio a causa di una caduta.
   2. Engage trave a sbalzo con la membrana.
   3. Seguire il protocollo del particolare dispositivo AFM per acquisire aree di interesse.

Results

Specie reattive dell'ossigeno e Deformazione

Precedenti studi hanno mostrato un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle vie respiratorie e cellule epiteliali alveolari in risposta al tratto ciclica ^21. Le specie reattive dell'ossigeno includono molecole e radicali liberi derivati ​​da ossigeno molecolare con alta reattività di lipidi, proteine, polisaccaridi e acidi nucleici ^22-24. ROS servire come un segnale comune intracellulare di regolare fu...

Discussion

Un dispositivo unico per l'imaging cellulare dal vivo durante allungamento meccanico è stato sviluppato; e questo dispositivo è stato utilizzato in un protocollo per studiare epiteliali polmonari mechanobiology cellule. In studi preliminari, si è constatato che un singolo tratto tenuta stimolato la produzione di superossido mitocondriale nelle cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, è stato dimostrato che un aumento dei livelli di sollecitazioni meccaniche causate danno diretto per l'integrità di un monostrato d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartMotor NEMA 34: Serie 3400	MOOG Animatics	SM3416D	Motore integrato, controller, amplificatore, encoder e bus di comunicazione
Flexcell Membrana (rivestita in collagene I)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5"  x  5,25"  x  0,020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI colorante
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	etichetta di superossido mitocondriale
Inibitore di superossido	DMEM
FBS
HEPES
provette da 50 ml	Fisher Scientific	06-443-19	Qualsiasi provetta di centrigo può essere utilizzata per creare un'area per l'imaging.
Forno di ibridazione	Celle Bellco Glass
MLE12 ATCC		CRL-2110	Cellule epiteliali polmonari di topo
Cellule 16HBE	ATCC	CRL-2741	Cellule epiteliali bronchiali umane
AFM Indentation ExperimentsCantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30 AFM
	Asilo Ricerca	MFP3D
Microscopio Olympus	Olympus	IX-71	Microscopio invertito con obiettivi 20X e 40X.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Non disponibile	AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopis
Digital microscopio	Life Technologies	EVOS XL Core	Inizialmente un'azienda indipendente, ora di proprietà di Life Technologies.
Microscopio confocale	Zeiss	LSM 710	Microscopio dritto a 2 fotoni