Articolo metodologico

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

DOI:

10.3791/52737

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19 agosto 2015

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1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Imaging, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Memphis, 4Department of Engineering Technology, University of Memphis

In questo articolo

Sommario

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Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Abstract

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C'è attualmente un notevole interesse nel capire come le cellule e i tessuti rispondono agli stimoli meccanici, ma gli approcci attuali sono limitati nella loro capacità di misurare le risposte in tempo reale in cellule vive o tessuti vitali. È stato sviluppato un protocollo con l'uso di un attuatore cellulare per distendere le cellule vive cresciute o i tessuti attaccati a un substrato elastico durante l'imaging con microscopia confocale e a forza atomica (AFM). Studi preliminari dimostrano che lo stretching tonico delle cellule epiteliali bronchiali umane ha causato un aumento significativo della produzione di superossido mitocondriale. Inoltre, utilizzando questo protocollo, le cellule epiteliali alveolari sono state allungate e sottoposte a immagini, il che ha mostrato un danno diretto alle cellule epiteliali per sovradistensione, simulando una forma di lesione polmonare in vitro. Viene inoltre fornito un protocollo per condurre la nano-indentazione AFM su celle allungate.

Introduzione

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Le cellule sono sottoposte a sollecitazioni meccaniche in molti tessuti, e questa stimolazione meccanica ha dimostrato di promuovere cambiamenti nei modelli di espressione genica, il rilascio di fattori di crescita, citochine, o rimodellamento della matrice extracellulare e citoscheletro 1-4. I segnali intracellulari trasdotte da tali stimoli meccanici avvengono attraverso il processo di meccanotrasduzione 5-7. Nel sistema respiratorio, un risultato di mechanotransduction è l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) 8,9 e citochine pro-infiammatorie 10 in cellule epiteliali polmonari in presenza di deformaz....

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Protocollo

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1. Costruzione di membrana con Well Mura per la conservazione di cellule di coltura (vedi Figura 1D per il prodotto finale)

  1. Utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) fogli rivestiti con collagene I, tagliare il contorno della membrana flessibile con un bisturi o un dado.
  2. Posizionare ogni membrana in una piastra di Petri di 60 mm per immagazzinaggio.
  3. Creazione di pareti:
    1. Mescolare PDMS in un rapporto di 10: 1 in peso di elastomero A a elastomero B (induritore).
    2. Versare 5 ml di PDMS completamente misti in provette da 50 ml.
    3. Mettere 50 ml tubi con PDMS TDS orizzontalmente in un fornetto.
    4. Utilizzare la f....

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Risultati

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Specie reattive dell'ossigeno e Deformazione

Precedenti studi hanno mostrato un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle vie respiratorie e cellule epiteliali alveolari in risposta al tratto ciclica 21. Le specie reattive dell'ossigeno includono molecole e radicali liberi derivati ​​da ossigeno molecolare con alta reattività di lipidi, proteine, polisaccaridi e acidi nucleici 22-24. ROS servire come un segnale comune intracellulare di.......

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Discussione

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Un dispositivo unico per l'imaging cellulare dal vivo durante allungamento meccanico è stato sviluppato; e questo dispositivo è stato utilizzato in un protocollo per studiare epiteliali polmonari mechanobiology cellule. In studi preliminari, si è constatato che un singolo tratto tenuta stimolato la produzione di superossido mitocondriale nelle cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, è stato dimostrato che un aumento dei livelli di sollecitazioni meccaniche causate danno diretto per l'integrità di un monostrato d.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare che Fedex Institute of Technology presso l'Università di Memphis per il loro sostegno. Gli autori desiderano ringraziare gli studenti del gruppo di progetto di design di alto livello presso il Dipartimento di Ingegneria Meccanica presso l'Università di Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn del dipartimento Università di Memphis Engineering Technology per il controllo motore , e il dottor Bin Teng e la signora Charlean Luellen per il loro aiuto in coltura cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto da K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SmartMotor NEMA 34: Serie 3400MOOG AnimaticsSM3416DMotore integrato, controller, amplificatore, encoder e bus di comunicazione
Flexcell Membrana (rivestita in collagene I)Flexcell International CorpSM2-1010C3.5"  x  5,25"  x  0,020"
Sylgard 184Dow Corning Corporation10:1
Hoechst 33342 Sigma-AldrichH1399DAPI colorante
MitoSOXSigma-AldrichM36008
TironSigma-AldrichD7389 etichetta di superossido mitocondriale
Inibitore di superossidoDMEM
FBS
HEPES
provette da 50 mlFisher Scientific06-443-19Qualsiasi provetta di centrigo può essere utilizzata per creare un'area per l'imaging.
Forno di ibridazioneCelle Bellco Glass
MLE12 ATCCCRL-2110Cellule epiteliali polmonari di topo 
Cellule 16HBEATCCCRL-2741Cellule epiteliali bronchiali umane
AFM Indentation ExperimentsCantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30 AFM 
Asilo RicercaMFP3D
Microscopio OlympusOlympusIX-71Microscopio invertito con obiettivi 20X e 40X.
AFM Leg ExtendersAsylum ResearchNon disponibileAFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUSSimulia6.12
Software
ImageJNIH
Microscopis
Digital microscopioLife TechnologiesEVOS XL CoreInizialmente un'azienda indipendente, ora di proprietà di Life Technologies.
Microscopio confocaleZeissLSM 710Microscopio dritto a 2 fotoni

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E.

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Microscopia a forza atomicamicroscopia confocalecellule epiteliali polmonari di topospecie reattive dell ossigenosuperossido mitocondrialemodulo elasticonanoindentazioneattuatore cellulare

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