Articolo metodologico

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio

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DOI:

10.3791/52742

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24 giugno 2015

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

In questo articolo

Sommario

L'imaging del comportamento e dell'attività neurale su scale temporali lunghe senza immobilizzazione dell'animale è un prerequisito per comprendere il comportamento. L'imaging delle camere microfluidiche di agarosio (AMI) può essere utilizzato per visualizzare l'attività neurale e il comportamento per tutte le fasi della vita di Caenorhabditis elegans.

Abstract

Comportamento è controllato dal sistema nervoso. Calcio Imaging è un metodo semplice nel nematode Caenorhabditis elegans trasparente per misurare l'attività di neuroni durante vari comportamenti. Per correlare attività neurale con il comportamento, l'animale non deve essere immobilizzata, ma dovrebbe essere in grado di muoversi. Molti cambiamenti comportamentali si verificano durante scale temporali lunghe e richiedono la registrazione di più di molte ore di comportamento. Questo rende anche necessario cultura i vermi in presenza di cibo. Come possono i vermi essere colta e la loro attività neurale ripreso su scale temporali lunghe? Agarose Microchamber Imaging (AMI) è stato precedentemente sviluppato per la cultura e osservare piccole larve e ora è stato adattato per studiare tutte le fasi della vita dai primi di L1 fino alla fase adulta della C. elegans. AMI può essere eseguita su diverse fasi di vita di C. elegans. Calcio Imaging a lungo termine viene ottenuta senza immobilizzare gli animali utilizzando le esposizioni a breve innescate esternamente comcombinati con un elettrone moltiplicando registrazione dispositivo (EMCCD) fotocamera ad accoppiamento di carica. Zoom out o la scansione in grado di scalare fino questo metodo per immagine fino a 40 vermi in parallelo. Così, viene descritto un metodo per il comportamento di immagine e l'attività neurale su scale temporali lunghe in tutti gli stadi di vita di C. elegans.

Introduzione

Caenorhabditis elegans è stato stabilito come sistema modello per studiare il comportamento1. Grazie alla sua adattabilità alla genetica, i meccanismi molecolari e cellulari alla base del comportamento possono essere studiati. Molti comportamenti si verificano su scale temporali lunghe. Due approcci principali possono essere utilizzati per osservare gli animali mobili su lunghe scale temporali. Il primo approccio consiste nel seguire l'animale durante il movimento utilizzando un tavolino automatizzato o una telecamera2-8 e il secondo consiste nel limitare il movimento a un raggio che sia almeno piccolo quanto il campo visivo della telecamera9-14. Entrambi i metodi hanno i loro vantaggi. Il tracciamento consente di seguire un animale su lunghe distanze spaziali, ma limita il numero di animali che possono essere distinti in un esperimento. Limitare il movimento degli animali consente di aumentare l'osservazione a molti individui contemporaneamente utilizzando matrici di compartimenti ristretti.

Poiché il nematode è trasparente, l'imaging fluorescente dal vivo può essere eseguito in modo non invasivo15. L'imaging del calcio fornisce una lettura funzionale per l'attività delle cellule eccitabili ed è stabilito per C. elegans16-20. Il calcio entra nella cellula attraverso i canali della membrana plasmatica che si aprono dopo la depolarizzazione. Pertanto, il calcio funge da proxy per l'attività neurale. I sensori di calcio possono essere raggruppati in due classi principali, sensori raziometrici e non raziometrici. Entrambe le classi impiegano cambiamenti conformazionali delle proteine leganti il calcio indotte dal legame del calcio. I sensori raziometrici contengono due proteine fluorescenti. Quando la proteina fluorescente a lunghezza d'onda più bassa viene eccitata, una parte dell'energia luminosa viene trasmessa alla proteina fluorescente a lunghezza d'onda più alta in funzione della loro distanza in un processo chiamato trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza o trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET)21. I sensori non raziometrici si basano sulla GFP permutata circolarmente e impiegano la de-quenching del fluoroforo causata dal legame del calcio22. Ogni classe ha i suoi vantaggi. Mentre i sensori raziometrici sono meno sensibili agli artefatti di movimento o di espressione, i sensori non raziometrici hanno in genere una gamma dinamica più elevata. Sia i sensori raziometrici che quelli non raziometrici sono stati utili per studiare l'attività delle cellule eccitabili in C. elegans16-20,23,24.

Quando si esegue l'imaging a fluorescenza a lungo termine, lo sperimentatore dovrà affrontare diverse potenziali sfide: 1. Disturbo del comportamento attraverso la luce di eccitazione: i vermi sono sensibili alla luce di eccitazione della fluorescenza a lunghezza d'onda corta ed evitano la luce dalla gamma dal viola al blu che viene utilizzata per l'imaging del calcio25,26. I vermi rispondono con una risposta di fuga all'indietro o in avanti25,26. Pertanto, la quantità di luce deve essere controllata. 2. Sbiancamento della proteina del sensore fluorescente: spesso, lo sbiancamento della proteina fluorescente ostacola l'imaging a lungo termine. Tipicamente, tuttavia, le intensità luminose necessarie per osservare lo sbiancamento sono superiori alle intensità luminose che causano effetti disturbanti sul comportamento degli animali. Pertanto, lo sbiancamento è solo un problema teorico in questo tipo di imaging del calcio. 3. I vermi all'interno delle microcamere non sono fissi e si muovono costantemente durante il comportamento di veglia e le immagini possono apparire sfocate se il verme non è immobilizzato. Tutte queste sfide possono essere risolte utilizzando tempi di esposizione estremamente brevi con bassa intensità luminosa. Ciò può essere realizzato utilizzando una telecamera EMCCD altamente sensibile con tempi di esposizione brevi e attivazione esterna di un diodo a emissione di luce (LED). Per esporre i vermi alla luce di illuminazione il più brevemente possibile (solo durante il tempo di esposizione della fotocamera), il LED viene attivato esternamente utilizzando un segnale logico transistor-transistor (TTL) che la fotocamera emette durante l'esposizione, con conseguente illuminazione del verme per il tempo preciso in cui il chip della fotocamera è esposto. Ciò significa anche che il chip EMCCD sarà scuro durante la lettura dei dati, il che è ottimale per le prestazioni di lettura di questo chip.

In precedenza, sono state sviluppate microcamere di agarosio per l'imaging a fluorescenza a lungo termine delle larve di C. elegans 9. Qui viene descritto come le microcamere di agarosio possono essere utilizzate per l'imaging del calcio a lungo termine per qualsiasi fase di vita di C. elegans, come può essere eseguito l'imaging del calcio e come questo metodo può essere potenziato per saggiare molti singoli vermi in parallelo.

Protocollo

1. Gli strumenti, di coltura, e piatti

  1. Utilizzare un microscopio che è in grado di mantenere il campione selezionato e che è dotato di una fase automatica. Costruire un calorifero coperchio su misura o acquistare una soluzione commerciale. Impostare un sistema di telecamere a LED-EMCCD in cui l'esposizione della fotocamera trigger illuminazione LED attraverso un segnale TTL con le istruzioni del produttore.
    Nota: vedere Consigli per i dettagli.
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) francobolli:
    1. Realizzare PDMS francobolli in un impianto di microfluidica o che abbiano le PDMS francobolli prodotte da una fonderia commerciale. Per usare una fonderia commerciale, inviare un file autocad alla società e specificare la profondità (15 micron, ad esempio) del dispositivo. Dopo la consegna dalla fonderia, tagliate il chip PDMS nei suoi 16 francobolli con un bisturi.
    2. Incollare ogni singolo francobollo di un vetrino con plasma ad aria. Per l'incollaggio, esporre sia il timbro PDMS e il vetrino di plasma ad aria per unaattacco 1 min (utilizzando le impostazioni più alte di plasma a 0,5 mbar). Assicurarsi che le superfici di incollaggio rivolti verso l'alto durante il trattamento al plasma. Quindi, mettere il timbro PDMS sul vetrino.
  3. Dai piatto fondo di 3,5 cm e tagliare una superficie quadrata di 18 x 18 mm dal centro del fondo del piatto con una fresatrice verticale e taglierine taglienti. Utilizzare bassa velocità di rotazione della fresa e l'alimentazione lenta per impedire la plastica da fusione a causa di calore prodotto per attrito. Preparare diversi piatti contemporaneamente.
    Nota: Il piatto inferiore può essere riutilizzato più volte dopo l'esperimento, se è pulito dopo immersione in puro etanolo O / N.
  4. Agarosio:
    1. Sciogliere 3 g alta punto di fusione agarosio in 100 ml S-basali (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in etanolo), H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclave), facendo bollire. Preparare delle aliquote del disciolto agarosio in 2 ml provette Eppendorf e store. Inoltre, preparare un lotto di basso punto di fusione agarosio esattamente allo stesso modo del punto agarosio alta fusione.
    2. Prima dell'uso, posizionare 3 aliquote di alto punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C. Prima dell'uso, posizionare un'aliquota di basso punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C fino a quando non è fuso e poi su una piastra riscaldante a 30 - 35 ° C.

2. Selezione degli animali

  1. Crescere i vermi a bassa densità su piastre NGM teste di serie per ottenere animali puri. Assicurarsi che non vi è abbondanza di cibo e solo pochi animali sul piatto.
  2. Per l'imaging L1 larve, trasferire circa 30 uova contenenti embrioni allo stadio di pretzel su un piatto fresco seminato NGM. Per il trasferimento di fasi successive larvali o adulti C. elegans, il trasferimento di circa 30 vermi su un piatto fresco seminato NGM.

3. Preparazione di agarosio microchambers

  1. Preparazione del piatto:
    1. Prendere un piatto di plastica con una apertura quadrata di 18 x 18 mm in basso e posizionarlo a rovescio con l'apertura rivolta verso l'alto. Chiudere l'apertura mettendo un pezzo di nastro biadesivo appiccicoso di 20 x 20 mm sull'apertura. Ruotare il piatto intorno in modo che il nastro adesivo è sul fondo e posizionare il piatto su una superficie dura. Tagliare l'apertura libera con un bisturi.
    2. Usando una pipetta P1000, occupare 2 ml di 3% di alta punto di fusione agarosio in S-basale nel piatto. Inserire l'agarosio sulla zona che circonda l'apertura e lasciare solidificare. Attendere che l'agarosio è solido.
    3. Girare intorno al piatto e staccare la pellicola protettiva che ricopre il nastro adesivo su due lati in modo che la parte adesiva rimane sul piatto e verrà esposta.
      Nota: Come risultato, un sottile anello di nastro adesivo circonderà all'esterno dell'apertura. L'agarosio funge da serbatoio di umidità che poi circondare il campione.
  2. Casting di microchambers:
    1. Esporre the superficie PDMS per lo stampaggio con plasma ad aria per 20 - 60 sec.
      Nota: Questo trattamento al plasma rende PDMS superficie idrofila, che impedisce l'intrappolamento di bolle d'aria e produce stampe nitide.
    2. Costruire due distanziatori di uguale altezza impilando 5-9 vetrini. Place, parallelamente ai loro lati lunghi, il primo gruppo distanziali, poi un singolo vetrino, poi ancora una pila distanziale. Posizionare il vetrino che contiene il timbro PDMS ortogonalmente attraverso i distanziali. Regolare l'altezza dei distanziatori in modo che vi sia uno spazio di circa 1,5 mm tra la superficie di formatura dello stampo PDMS e il singolo vetrino.
    3. Mettere una goccia di liquido caldo ad alto punto di fusione agarosio sul vetrino singolo vicino al timbro PDMS e rapidamente scivolare il PDMS bollo verticalmente nel agarosio liquido. Lasciate che il agarosio solidificare. Verificare che diventa un aspetto opaco, che di solito dura circa 2 minuti. Estrarre il timbro in verticale con un movimento.
      Nota: E 'conveniente per glue il distanziatore scorre insieme con nastro biadesivo appiccicoso. Il movimento verticale del timbro impedisce bolle d'aria dal rimanere intrappolati in agarosio.
  3. Trasferire le uova o vermi insieme con i batteri OP50 sul agarosio utilizzando una raffinata scelta filo di platino. Distribuire un uovo o una vite senza fine per ogni camera insieme con il cibo usando un ciglio. Riempire circa 30 uova su un pad agarosio.
  4. Tagliare lastra agarosio contenente i microchambers riempite in un quadrato di circa 15 x 15 mm in modo che si adatta bene nell'apertura del piatto. Sollevare la lastra di agarosio piazza con una pinza e posizionarlo a testa in giù su un vetrino di vetro di 20 x 20 mm. Una volta sceso, non sollevare di nuovo o scorrere in giro perché ciò può causare i batteri e vermi per essere spinto fuori dalle loro stanze.
  5. Montaggio del piatto:
    1. Posizionare il coprioggetto di vetro sulla apertura del piatto di plastica. Premere delicatamente verso il basso il vetrino di vetro sul ring in doppia faccia nastro adesivo.Fare attenzione a non rompere il vetro.
    2. Girare il piatto a testa in giù e usare una pipetta P1000 per colmare il divario tra la soletta agar contenente le microchambers e il serbatoio agarosio con liquido a basso punto di fusione agarosio raffreddata a circa 30 ° C. Attendere che l'agarosio si è solidificato.
    3. Sigillare il piatto con un coperchio. Per microscopi invertiti utilizzare un coperchio riscaldato. Per microscopi diritti utilizzare un coperchio normale e sigillare il piatto con Parafilm.
  6. Dopo aver terminato la preparazione di microchambers, controllarli sotto uno stereomicroscopio. Il ripieno corretta è fondamentale. Vedi la discussione per i dettagli.

4. Imaging di calcio

  1. Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati quali HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27.
  2. Utilizzare un microscopio composto attrezzato per tutto il campo epifluorescenza. Collegare l'uscita TTL della fotocamera EMCCD al'ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la fotocamera registra un fotogramma campione sarà illuminato. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Utilizzare guadagno EM nel range di 50-300.
  3. Specificare una corsa film di scoppio per 24 ore con ogni verme essere ripreso ogni 15-30 minuti prima per 20 secondi con DIC, poi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, e poi prendere una immagine finale del segnale mKate2 è preso a di controllo per i livelli di espressione. Utilizzare un frame rate di 2 / sec durante ogni raffica.
  4. Per il controllo dei dati visivi, usare una mappa falsi colori per migliorare la visibilità delle piccole variazioni di intensità di fluorescenza. Dati fluorescenti trama come Af / F, con F è il valore medio basale di fluorescenza. Una descrizione dettagliata di analisi dei dati calcio può essere trovato in letteratura 20.

5. parallelo AMI di multiple Worms

  1. Porre la capsula contenente i microchambers sul microscopio, concentrarsi sul campione e coinvolgere il autofocus. Impostare un protocollo software in modo che la fotocamera acquisisce una raffica di 40 fotogrammi di immagini in 20 secondi ogni mezz'ora per 24 ore, che si tradurrà in 1.920 fotogrammi al verme, una ragionevole quantità di dati. Impostare la scansione in modo che visita ogni verme con il palcoscenico. Lo scopo di filmare circa 30 vermi in una corsa.
  2. Immagine più vermi per lo zoom out, vale a dire, con un ingrandimento minore. Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire più microchambers con il chip telecamera e filmare contemporaneamente più microchambers adiacenti. Dopo la fine della acquisizione dell'immagine, separare i dati per ogni singola camera ritagliando una regione di interesse che copre un animale.
  3. Per valutare rapidamente i dati di mobilità, utilizzare telaio sottrazione 28-32.

6. Imaging diverse fasi della vita di C. elegans

  1. Utilizzare microchambers agarosio per tutte le fasi della vita di C. elegans da L1 a compresi dauers adulti e. Utilizzare i opportune dimensioni della camera per difle fasi della vita di- che sono indicati nella tabella 1.
Fase di vita Formato da Camera Profondità fornello Tempo di registrazione tipico Ingrandimento
L1 190 x 190 micron 10 - 15 micron uovo - mid L2 400X
L2 370 x 370 micron 15 micron uovo - L3 200X
Dauer larva 370 x 370 micron 25 micron 4 giorni 200X
L3 700 x 700 micron 45 micron L2 - L4 200X
L4 700 x 700 micron 45 micron giovane L4 - giovane adulto 100X
Giovani adulti 700 x 700 micron 45 micron 12 - 24 ore 100X

Tabella 1. formati da camera per diverse fasi della vita. Visualizzati sono Dimensioni camera e ingrandimenti che sono utili per varie fasi ottimizzate per un chip telecamera 8 x 8 mm.

Risultati

Microchambers Agarose possono essere applicati a qualsiasi fase della vita di C. elegans. Come si può vedere nella Figura 1A, sviluppo larvale e comportamento sonno durante L1 lethargus possono essere osservati. Vengono mostrati dimensioni delle camere che sono 190 x 190 micron, 10 micron di profondità. Se sono necessari tempi più lunghi, possono essere utilizzati camere più grandi. Come si vede in Figura 1B, utilizzando una camera di dimensioni maggiori (370 x 370 micron, 25 micron profondo) consente lo sviluppo di C. elegans da uovo fino adulto. Figura 1C mostra l'analisi dei cambiamenti a lungo termine nel comportamento con telaio sottrazione di un verme cresciuto in una camera da uovo fino adulta. Indicato sono intensità media dopo telaio sottrazione per raffiche selezionati durante veglia e lethargus. Minore è l'intensità media dopo valori telaio sottrazione è, minore è la mobilità del verme. Indicato sono selezionati scoppio tracce da una condizione veglia e una condizione lethargus per stadio larvale. Ilosservato aumento di intensità media durante lo sviluppo è dovuto principalmente alla maggiore contrasto e dimensioni dell'animale. figura 1D mostra una larva dauer, una fase di vita alternativo che opera in condizioni ambientali avverse 33. Formato da Camera è di 370 x 370 micron, 15 micron di profondità. Si noti che la larva Dauer è stata posta nella camera senza cibo batterica, che causerebbe l'uscita dalla fase larvale Dauer. La figura 1E mostra un verme adulto che ha già gettato molte uova nella camera. Dimensioni camera utilizzate per l'adulto sono 700 x 700 micron, 45 micron di profondità. Infine, la Figura 1F mostra un ermafrodita adulto e un accoppiamento maschio all'interno di una camera adulta.

Calcio Imaging in vermi motilità è possibile con sensori di calcio GCaMP. Figure 2A, B spettacolo Imaging di calcio del comando interneurone AVA per una larva L1 27. Figure 2C, D mostrano l'attività di calcio per la sami tipo di neurone in un animale adulto.

Scaling up di imaging a lungo termine è possibile attraverso la scansione e zoom out. Figura 3A mostra la qualità delle immagini delle immagini simultanea di 30 vermi su un unico chip fotocamera con una fotocamera da 5 megapixel. Figura 3B mostra la qualità dell'immagine di 4 vermi calcio ripreso contemporaneamente.

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Figura 1. Adeguamento della AMI a tutte le fasi della vita di C. elegans. (A) Larva ripreso dai primi di L1 fino all'inizio fase L2 in 190 x 190 micron camere. (B) per lo sviluppo da uovo fino adulto in una camera di 370 x 370 micron. (C) La mobilità di un worm valutata utilizzando telaio sottrazione. Viene mostrato l'intensità media di tutte le foto dell'immagine dopo telaio sottrazione di un film raffica selezionato per ogni sta larvalege per svegliarsi e comportamento lethargus. (D) Un dauer larva in assenza di cibo in una camera 370 x 370 um. Ermafrodita (E) per adulti con molte uova deposte in una camera di 700 x 700 micron. (F) L'accoppiamento di un maschio e una ermafrodita all'interno di una camera 700 x 700 um. YA significa giovane adulto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Imaging di calcio con IMA. (A) Calcio Imaging con GCaMP3 nel comando interneurone AVA di L1 larve utilizzando la NMR-1 promotore. Indicato sono due immagini a falsi colori. Nell'immagine di sinistra, l'attività di AVA è bassa e il verme non sta compiendo un movimento all'indietro. Nell'immagine a destra l'attività di AVA è alta, e il verme si muove all'indietro. transitori (B) di calcio nel corso del tempo per un worm L1. (C, D) transienti di calcio in un animale adulto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Imaging più vermi in parallelo con lo zoom out. (A) l'imaging simultaneo di 30 L1 vermi per fotogramma con 190 x 190 micron camere e un ingrandimento 100X (con un obiettivo 10X) e un chip di fotocamera 16,6 x 14 mm. (B) l'imaging simultaneo di quattro vermi L3 per fotogramma con 370 x 370 micron camere e 100X ingrandimento e una regione di interesse di un chip fotocamera 16,6 x 14 mm.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Hardware

L'obiettivo di un microscopio tipicamente deriva durante l'acquisizione dell'immagine a lungo termine. Per microscopi composti, focus-mantenendo sistemi possono essere acquistati presso i maggiori produttori microscopio. Nel caso in cui un microscopio composto con controllo di fuoco è troppo caro, una semplice alternativa sarebbe quella di utilizzare uno stereomicroscopio. Microscopi composti consentono l'uso di obiettivi con alta apertura numerica (NA) e può essere facilmente automatizzato. Obiettivi olio 40X sono adatti. Lenti immersione in acqua non sono l'ideale per l'evaporazione durante l'imaging a lungo termine. Contrasto interferenziale differenziale (DIC) genera un piacevole contrasto che aiuta a seguire i cambiamenti morfologici e comportamentali, ma semplice per immagini campo luminoso può essere utilizzato anche. Per DIC o l'imaging campo chiaro, utilizzare la luce rossa posizionando un filtro di luce rossa nel percorso dia-illuminazione del microscopio. Per la scansione di diversi microchambers è necessaria una fase automatizzata. Miglior performance è achieved quando una fase è utilizzato che ha l'accelerazione lineare e decelerazione e può essere impostato a bassa velocità di scansione per evitare di disturbare gli animali durante la scansione. Non abbiamo osservato le risposte comportamentali o aumento di calcio nei neuroni meccanosensibili (ALM e PLM) durante la scansione, suggerendo anzi che la scansione lenta non attivare il sistema meccanosensibili del worm (dati non riportati). Sistemi commerciali LED possono essere utilizzate. Diverse aziende offrono soluzioni pronte per l'uso che comprendono i LED a diverse lunghezze d'onda. Il LED deve avere la possibilità di innescare esternamente LED con un segnale TTL. Una telecamera altamente sensibile è necessaria per l'imaging di calcio degli animali in movimento. Telecamere EMCCD sono le telecamere più sensibili sul mercato. La telecamera deve avere un'uscita TTL durante l'esposizione (detta anche output "fuoco"). Un riscaldatore coperchio è necessaria per evitare la formazione di condensa sul coperchio se si usa un microscopio invertito. Su un microscopio verticale, il piatto viene posizionato in modo che il coperchio will essere in basso e quindi la condensazione è impedito e non necessita riscaldamento coperchio. Il coperchio deve chiudere ermeticamente il piatto per evitare l'evaporazione di acqua durante l'imaging a lungo termine.

PDMS francobolli

La superficie del timbro PDMS che contiene la struttura per lo stampaggio l'agarosio è affrontato dal vetrino, che supporta il timbro PDMS. Una lista con le aziende che offrono chip microfluidici personalizzato può essere trovato su Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Riempimento dei nematodi nelle loro camere

Questa è la fase più critica del protocollo ei seguenti punti deve essere considerato: A) L'umidità del agarosio è fondamentale per trasferire i vermi e per l'imaging. Se l'agarosio è troppo umida, ossia, c'è una COV liquidorendo un'area di diversi microchambers, non sarà possibile distribuire cibo batterica e vermi in modo controllato perché il liquido farà batteri defluire. Se l'agarosio è troppo asciutto, quindi i batteri e vermi non possono scendere il pick facilmente il che significa che maggiore forza deve essere utilizzato per eliminare i vermi e batteri che causano facilmente danneggiare il agarosio. Nel compilare un sacco di vermi agarosio può asciugare. Nel peggiore dei casi l'agarosio sarà così asciutto alla fine che le camere crollerà. Se l'agarosio è troppo secca può essere reidratato mettendo una piccola goccia (circa 2 ml) di S-basale sul lato del chip dove non ci sono vermi. Poi immergere il filo di platino raccogliere nel liquido e anche tirare una parte del liquido nella zona in cui le camere sono piene di vermi. B) La quantità di cibo è fondamentale per il successo di imaging a lungo termine. Se non c'è abbastanza cibo, i vermi possono correre fuori di esso. Se c'è cibo eccessiva la cavità della cameranon si comporterà come un liquido, ma piuttosto come un solido e consentirà worm per fuggire dalla camera spingendo i batteri. Obiettivo per ottenere una sospensione batterica che riempie l'intera camera. I vermi sono in costante contatto fisico con la superficie di agar e vetro lungo la maggior parte della loro lunghezza durante l'esperimento e il comportamento strisciando sembra essere simile al movimento su un piatto e dissimile da thrashing in liquido. C) meccanica danneggiamento del agarosio può rovinare l'esperimento. Una bella scelta è essenziale. Non dovrebbe avere spigoli vivi. Un ciglia morbido attaccato ad una punta di pipetta può essere utilizzato per spostare batteri o vermi nelle camere invece di utilizzare un pick platino. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, agarosio eccessiva asciugatura è la ragione per danni. Il pick o ciglia dovrebbero, idealmente, solo toccare appena l'agarosio in sé, e la pellicola d'acqua sulla superficie di agarosio dovrebbe tirare fuori i vermi e batteri. Quando sigillando le camere, di nuovo, l'umidità del agarosio è essenziale. Non ci dovrebbeessere qualsiasi liquido libero sulla superficie agarosio perché questo può lavare via i batteri e vermi durante la saldatura. Grandi bolle possono essere rimosse sollevando delicatamente un angolo della lastra agar. Piccole bolle che sono più piccole della camera spesso intrappolate all'interno delle camere. Queste bolle non sono un problema e spariranno per assorbimento. Dopo il montaggio del piatto, verificare ancora una volta che l'agarosio non è troppo secca o troppo umida. Le camere devono essere ben sigillati e non ci dovrebbe essere qualsiasi flusso di liquido tra le camere. Se l'agarosio è troppo bagnato, le camere non corretta tenuta. Worms possono sfuggire o il loro cibo sarà spazzato via. Se il campione è troppo umida, semplice aprire il coperchio e lasciare asciugare agarosio per un minuto o due. Se l'agarosio è troppo secca, le camere possono crollare e il worm si sfuggire.

Scaling da zoom out

Per l'imaging di fluorescenza, zoom indietro è limitata dalla scarsa quantità di luce ottenuta a visualizzazioni ridotte. Inoltre, ETelecamere MCCD sono ottimizzati per la sensibilità e spesso hanno una risoluzione relativamente bassa. Tuttavia, scaling up di immagini di quattro volte è ben possibile. Ad esempio, quattro camere di 190 micron x 190 micron può andare bene su un unico fotogramma utilizzando 140X ingrandimento (ottenuto utilizzando un 20X Obiettivo e una fotocamera 0,7X montaggio) e 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm fotocamera. Una telecamera ad alta risoluzione con una grande chip (come macchine fotografiche sCMOS, 16,6 millimetri di chip x 14 mm, 2560 x 2560 pixel = 5.5 Megapixel) ottimizza scaling up di CID e di imaging in campo chiaro. Ad esempio, fino a 30 vermi L1 a 190 micron x 190 micron camere può andare bene su ogni fotogramma di questa fotocamera quando si utilizza un ingrandimento 100x (vedi figura 3). In linea di principio, lo zoom indietro e di scansione può anche essere combinati per ottenere anche un numero maggiore di animali. La maggior parte dei neuroni rimangono abbastanza bene a fuoco, in modo che solo un piano focale deve essere ripreso. Se i neuroni si trovano ad uscire dal fuoco, az scansione utilizzando un sistema piezoelettrico può essere presa in ogni momento pmista.

Adattamento ai diversi comportamenti

Questo protocollo dà una buona idea del comportamento attraverso scale temporali lunghe. Ovviamente, la tempistica delle esplosioni deve essere adattato alle differenti comportamenti e le fasi della vita.

Limitazioni della tecnica

Diversi fattori limitano la durata di imaging. La più importante è la quantità di cibo. Una volta che il cibo è consumato, larve fermare lo sviluppo. Così, in piccole camere (190 x 190 micron) vermi si sviluppano fino alla fase L3 e quindi arrestano. Se è necessario un tempo più lungo di imaging, camere grandi devono essere utilizzati. La durata massima delle immagini a lungo termine è nel range di 2,5 - 3 giorni. Se è richiesta l'imaging più, i vermi devono essere recuperati e inseriti in nuove camere. Quando l'imaging vermi adulti, un'altra limitazione è causata dalla progenie di questi worm. Worm adulte depongono le uova da cui larve si schiudono. Queste larve anche rimanere all'interno della camera, Consumare cibo, e possono disturbare l'analisi delle immagini. Se prole è un problema, una soluzione è usare sia per adulti sterili o per effettuare ripetutamente i vermi in camere fresche. Per recuperare i vermi, la lastra agarosio contenente la camera è tagliato gratuito con un bisturi, è tirato fuori dal vetrino, e viene posto su una piastra NGM da cui i worm possono essere recuperati. Un altro limite è la restrizione dei vermi per aree relativamente piccole. Questo può essere un problema se il movimento lungo raggio deve essere analizzato. Mentre gli animali nelle camere possono essere stimolati meccanicamente e optogenetically 21,27,34,35, la natura sigillata della camera renderà difficile applicare stimolanti solubili o volatili. Gas biologicamente importanti quali ossigeno o anidride carbonica possono diffondersi liberamente nel agar. Il grande serbatoio dell'aria nel piatto dovrebbe mantenere le concentrazioni di gas nelle camere di costanti lungo il tempo necessario per gli esperimenti. Tuttavia, va tenuto presente che la concentratio ossigeno localin nella camera può assomigliare più condizioni esistenti in coltura liquida di coltura su piastra.

Importanza rispetto ai metodi esistenti

Dispositivi microfluidici hanno notevolmente avanzato del comportamento e dello sviluppo studiato in C. elegans. Spesso, strutture microfluidica sono fatti di PDMS 12. Qui si descrive un protocollo per la generazione di camere di coltura di microfluidica a base di agarosio. La forza di questa tecnica è la combinazione di elevata qualità delle immagini, la correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche, immagini a lungo termine, e una portata ragionevolmente alto. Alta qualità di immagine si ottiene l'imaging attraverso il vetrino di vetro con obiettivi alti NA. Come risultato, imaging di fluorescenza come l'imaging calcio e confocale delle strutture subcellulari può essere eseguita. Poiché gli animali non sono immobilizzati come in altri sistemi, permette una correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche. Because gli animali hanno cibo abbondante, che continuare a sviluppare permettendo di imaging a lungo termine. Questo sistema è in grado di immagine molti worm in una corsa perché gli animali sono limitate nelle loro stanze definite. Così, questo metodo può essere facilmente scalato 9,27,34-36.

Le future applicazioni

Finora, questo sistema è stato utilizzato principalmente per studiare il comportamento di sonno in C. elegans L1 larve. Tuttavia, l'adattamento a tutte le fasi renderà possibile studiare una vasta gamma di comportamenti anche in dauers e adulti. Una vasta gamma di comportamenti può essere studiata con questa tecnica che vanno da accoppiamento per la deposizione delle uova.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Il Max Planck Society e uno stipendio Gottinga Graduate School Junior Gruppo HB finanziato questo lavoro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio ad alto punto di fusioneFisher BioreagentiBP(E)164-1000
Top Vision Agarosio a basso punto di fusioneThermo ScientificR0801
Sistema LEDCoolLEDpE-2
Microscopio compostoNikonTiE
StereomicroscopioLeicaM5
EMCCDAndoriXon 897ora venduto come iXon Ultra 897
sCMOS cameraAndorNeo
Plasma cleanerHarrickPDC-23G2
Coperchio riscaldatoreMPI officinasu misura
Piatto di plasticaFalcon08-757-100A
Z-stage per il microscopioPrecedenteNano Scan Z
X-Y stage per il microscopioPriorProscan III
Timbro PDMSAbbott Laboratoriessu misura
Filtro a luce rossaChromaET660/50m
Piastra di Petri da 35 mmFalconFalcon Piastre di Petri monouso, sterile, Corning
Nastro biadesivoSellotape/Henkelbifacciale 25 mm x 33 min alternativa è possibile utilizzare il nastro biadesivo avanzato di Rubance Adhesives.

Riferimenti

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