Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.
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Articolo metodologico
Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante l'infezione e l'infiammazione, monociti circolanti lasciano il flusso sanguigno e migrare nei tessuti, dove si differenziano in macrofagi. I macrofagi esprimono i recettori di superficie Toll-like (TLR), che riconoscono pattern molecolari conservate attraverso l'evoluzione in una vasta gamma di microrganismi. TLR svolgono un ruolo centrale nella attivazione dei macrofagi, che è di solito associata con l'espressione genica alterazione. I macrofagi sono fondamentali per molte malattie e sono emersi come bersagli attraenti per la terapia. Nel seguente protocollo, si descrive una procedura per isolare i macrofagi peritoneali murini utilizzando medio Thioglycollate di birra. Quest'ultimo incrementare la migrazione dei monociti nel peritoneo, di conseguenza tale da far salire il rendimento dei macrofagi per 10 volte. Diversi studi sono stati condotti utilizzando midollo osseo, milza o peritoneali derivati da macrofagi. Tuttavia, i macrofagi peritoneali hanno dimostrato di essere più maturo sull'isolamento e sono più stabili nella loro funzionalitàlità e fenotipo. Così, macrofagi isolati da murino cavità peritoneale presentano una popolazione importante cella che può servire in diversi studi immunologici e metabolici. Una volta isolato, i macrofagi sono state stimolate con differenti ligandi TLR e di conseguenza l'espressione del gene è stata valutata.
Introduzione
Il sistema reticoloendoteliale fagocitica è composto di cellule in vari tessuti ed organi come il midollo osseo, sangue, fegato e milza. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo, dove in particolare partecipano innata e risposte immunitarie per il controllo e le infezioni chiare. Oltre al loro ruolo nella difesa dell'ospite, macrofagi giocano un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nel mantenimento dell'omeostasi tissutale 1,2. Inoltre, i macrofagi non sono importanti solo per la funzione immunitaria, ma anche partecipare attivamente nell'omeostasi del ferro 3. Nel corpo, circa il 80% di ferro è presente ....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti per la cura degli animali, dopo l'approvazione da parte del Comitato istituzionale cura degli animali del Centro de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolamento, identificazione, e Cultura Murine Peritoneale macrofagi
- Preparare medio tioglicollato 3,8% di birra. Per fare ciò, sospendere 38 g di tioglicollato medie 1.000 ml di acqua distillata. Portare la soluzione ad ebollizione per sciogliere completamente il mezzo. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min. Memorizza fino a 3 mesi ....
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Risultati
Per prima cosa caratterizzati isolate macrofagi peritoneali murini mediante citometria a flusso. Per farlo, abbiamo utilizzato (F4 / 80) anticorpi che riconoscono specificamente i marcatori espressi solo da parte dei macrofagi. Questa caratterizzazione è necessaria per determinare la percentuale di isolati macrofagi e distinguerli tra cellule ottenute durante il processo di isolamento. Come mostrato in (figura 1), la percentuale di cellule che esprimono l'antigene F4 / 80 è stata costantemente risul.......
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Discussione
I macrofagi sono cruciali per la sopravvivenza e fornire un bersaglio allettante per manipolare l'host per obiettivi immunologici. La scoperta di TLR e di altre molecole di riconoscimento hanno condotto i macrofagi al centro del dibattito immunologica. Macrofagi rispondono ad una varietà di stimoli, compresi citochine, molecole danni associati molecolari modello (smorza) 20 e molecole associate a gruppi di patogeni (PAMP) 21. Queste diverse risposte stimoli rappresentano corso dell'attivazi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC, concedere senza 298515-2011). AL è il destinatario di un dottorato di ricerca borsa di studio le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC), e MS è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Canadian Institutes of Health Research (CIHR, concessione n. MOP123246).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 topi | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Tioglicolato | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% etanolo | |||
| 10% pentobarbital di sodio (utilizzato per l'anestesia dei topi (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), posta su ghiaccio e servirà per raccogliere i macrofagi | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Integratore con penicillina, streptomicina, L-glutammina e siero fetale di vitello al 10 | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| Siringhe da 1 e 5 ml | BD USA (NJ) | ||
| piastre a 6 pozzetti | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Lipoproteina batterica Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Poliionosina... acido policitidilico (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS da Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Flagellina purificata da Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derivato dalla lunga ripetizione terminale dell'HIV-1 ssRNA40 (1 μ g/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Tipo B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μ M) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| Aghi da 20 G e 23 G | BD USA (NJ) | ||
| Forbice Pinza | |||
| conici | |||
| da 50 ml posizionati su ghiaccio | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Emocitometro | |||
| per centrifuga | |||
| Anticorpo F4/80 | BIO-RAD (CA, USA) | ||
| Anticorpi CD16/CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Citometro | a flussoCoulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Provette Eppendorf da 1,5 ml | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Cloroformio | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Alcool isopropilico | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| Etanolo al 75% (in acqua trattata con DEPC) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| Acqua trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC) allo 0,01% (lasciare riposare durante la notte e in autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Sistema RT-PCR Omniscript | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| Kit PCR QuantiTect SYBR Green I | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Riferimenti
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
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Ristampe e permessi
