Articolo metodologico

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 maggio 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Abstract

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Oltre ai metodi affermati come Western blot, sono necessari nuovi metodi per quantificare rapidamente e facilmente malattia associata α-sinucleina (αS D) in modelli sperimentali di synucleopathies. Una linea di topi transgenici (M83) che sovra-esprimono i αS A53T umani e sviluppare spontaneamente una drammatica fenotipo clinico tra gli otto ei 22 mesi di età, caratterizzata da sintomi quali la perdita di peso, prostrazione e disabilità motoria grave, è stato utilizzato in questo studio. Per le analisi molecolari di αS D (αS associata a malattia) in questi topi, un test ELISA è stato progettato per quantificare specificamente αS D nei topi malati. Analisi del sistema nervoso centrale in questo modello di topo ha mostrato la presenza di αS D principalmente nelle regioni del cervello caudale e il midollo spinale. Non ci sono state differenze nella distribuzione αS D tra diverse condizioni sperimentali che portano alla malattia clinica, vale a dire, in uninoculated e normalmente invecchiamento topi transgenici e in topi inoculati con estratti di cervello di topi malati. La rilevazione specifica di αS D immunoreactivity utilizzando un anticorpo contro Ser129 fosforilata αS di ELISA essenzialmente correlati con quello ottenuto da Western Blot e immunoistochimica. Inaspettatamente, risultati simili sono stati osservati con diversi altri anticorpi contro la parte C-terminale di αS. La propagazione di αS D, suggerendo il coinvolgimento di un meccanismo di "prioni-like", può quindi essere facilmente monitorato e quantificata in questo modello murino utilizzando un approccio ELISA.

Introduzione

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La maggior parte dei metodi attuali per rilevare l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) nei modelli sperimentali di malattia di Parkinson (DP), come l'immunoistochimica o il Western blot, sono lenti e non quantitativi. Questa malattia neurodegenerativa è caratterizzata dall'aggregazione di alpha-sinucleina principalmente sotto forma di inclusioni contenenti una forma aggregata della proteina presinaptica normalmente solubile αS1,2 (corpi di Lewy e neuriti di Lewy). Normalmente solo marginalmente fosforilata, αS è iperfosforilata al suo residuo serina 129 in queste inclusioni3 e può essere monitorata da anticorpi specificamente diretti contro αS fosforilata su Ser129, fornendo così un marcatore affidabile della patologia.

Recenti ricerche suggeriscono che un meccanismo "simile ai prioni" potrebbe essere coinvolto nella propagazione dell'aggregazione di αS all'interno del sistema nervoso di un paziente affetto4,5. Questi studi hanno riportato l'accelerazione di una sinucleinopatia inoculando estratti cerebrali contenenti αSD in un modello di topo transgenico (M83) che esprime una proteina αS umana mutata A53T associata a un grave disturbo motorio che si verifica man mano che i topi invecchiano6. Allo stesso modo, l'inoculazione intracerebrale di αS ricombinante aggregato nello stesso modello di topo M83 ha confermato l'accelerazione dell'aggregazione5. L'induzione di depositi di αS fosforilata è stata riportata anche dopo l'inoculazione di topi selvatici C57Bl/6 con αS ricombinante fibrillare o estratti cerebrali di pazienti umani con DLB7,8. Sacino et al.9 hanno recentemente sottolineato che dopo l'iniezione di αS umano fibrillare, una formazione di inclusioni di αS cerebrale diffusa e progressiva potrebbe essere indotta nei topi M83, ma non nei topi transgenici E46K o nei topi non transgenici in cui le inclusioni di αS indotte erano transitorie e principalmente limitate al sito di iniezione. Studi recenti su scimmie hanno confermato la propagazione degli aggregati di αS dopo l'inoculazione di estratti derivati dalla DP in specie più vicine all'uomo10.

Il legame tra le alterazioni di αS e la malattia di Parkinson suggerisce che αSD è un potenziale biomarcatore per la malattia di Parkinson11. Uno studio recente ha mostrato il rilevamento di aggregati solubili oligomerici di α-sinucleina nel liquido cerebrospinale umano (LCS) e nel plasma come potenziale biomarcatore per la malattia di Parkinson basato su un sistema sandwich ELISA convenzionale utilizzando lo stesso anticorpo per catturare e rilevare αS12. Basandosi sullo stesso metodo, le proteine multimeriche sono state riconosciute in campioni biologici, incluso il cervello, poiché ci sono molteplici copie di epitopi presenti nelle forme assemblate13. Molto recentemente, l'αS patologico nel LCS di pazienti con una comprovata patologia dei corpi di Lewy è stato rilevato utilizzando sia un kit ELISA con un anticorpo altamente specifico contro αSD (5G4) sia un saggio di immunoprecipitazione14. Questi metodi potrebbero differenziare i pazienti con DP/DLB da altri tipi di demenza.

La propagazione "simile ai prioni" dell'aggregazione di αS è stata ulteriormente studiata nel modello di topo transgenico M83 utilizzando un approccio ELISA progettato per identificare specificamente αSD15. In questo studio, riportiamo il protocollo ELISA dettagliato utilizzato per rilevare quantitativamente αSD nei topi malati (inoculati o meno con αSD da topi M83 malati) e più in particolare nelle regioni cerebrali specificamente bersagliate dal processo patologico in questo modello di topo transgenico M834.

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Protocollo

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Tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono conformi alla direttiva 86/609 / CEE e ratificata da Cometh, il comitato nazionale francese per l'esame di etica nella sperimentazione animale (protocollo 11-0043), CE. Gli animali sono stati alloggiati e curati in Anses di impianti autorizzati sperimentali a Lione (approvazione B 69387 0801).

1. Preparazione di topi

  1. Euthanize topi da una iniezione intraperitoneale di dose letale di pentobarbital sodico.
  2. Recuperare l'intero cervello dal cranio del mouse e mettetelo in una capsula di Petri di plastica 35 millimetri in ghiaccio fino all'estrazione.
  3. Estrarre il midollo spinale cervicale.
    NOTA: αS Estratto sia da una delle due metà del cervello dopo sezionamento sagittale o dal cervello dei topi sezionati, disponibile dopo gli esperimenti elencati nella tabella 1.
Sperit Mice
Inoculo (equivalente cervello) 		Periodo di sopravvivenza
(Dpi) 		Mediana / sopravvivenza massima
(giorni) 		αS d individuazione da ELISA
/ WB / IHC
1 Topo inoculato 441 ± 166 419/736 8/8
2 Topi inoculati (0,2 mg) 150 ± 52 140/241 9/9

Tabella 1. Elenco degli esperimenti condotti sui topi M83. Vaccinazioni sono state eseguite a 6 settimane per l'esperimento 2 nella zona striato-corticale con 20 ml di un omogenato cervello di un topo malato (1% peso / volume in glucosata al 5%), dopo anestesia di sei settimane topi M83 omozigoti del 3% inalazione isoflurano. dpi: giorni dopo inoculzione.

2. αS estrazione da Brain Metà

  1. Sagittalmente tagliare il cervello per ottenere due metà. Pesare ogni metà in una provetta contenente ribolysis sfere di macinazione.
  2. Preparare sale elevato (HS) tampone contenente 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatasi e inibitori della proteasi cocktail. Aggiungere tampone Alta Sale le metà del cervello per ottenere il 20% (peso / volume) omogenati.
  3. Preparare campioni delle due metà del cervello con un omogeneizzatore meccanico a 6,0 m / s per 23 secondi per due volte. Dopo i primi 23 sec omogeneizzazione, posizionare i tubi contenenti i omogenati in ghiaccio per 2 minuti prima del secondo ciclo di 23 sec.
  4. Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti per eliminare i frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, dividerli in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA.

3. αS Estrazione da sezionato regioni cerebrali

  1. Sezionare unintero cervello in un piatto di plastica Petri 35 millimetri sul ghiaccio con una lente d'ingrandimento a bassa potenza (8X ingrandimento) utilizzando due forcipes cui estremità sono tenuti insieme, tranne quando sezionare l'ippocampo. Non superare 10 minuti per preservare l'integrità del cervello. Posizionare il cervello destro rivolto verso l'alto e recuperare i seguenti regioni del cervello in questo ordine:
    1. Separate uno dei due bulbi olfattivi con pinze poste appena dietro la lampadina. Staccarlo dal cervello con un movimento verso il basso. Ripetere questa operazione per la seconda lampadina.
    2. Cuneo delicatamente la pinza tra le due cortecce e spostarlo in avanti per facilitare dissociazione delle due cortecce. Mantenere il cervello in posizione con una pinza, utilizzare un altro per separare corteccia dal ippocampo.
    3. Posizionare le pinze 2 millimetri al di sotto della corteccia. Mantenere una leggera pressione sulle pinze fino all'inizio della ippocampo è visibile. Rimuovere la prima parte della corteccia, e ripetere con la seconda parte. Utilizzare le pinze per separare le due corteccepartendo nell'ippocampo e procedendo verso la parte anteriore del cervello.
    4. Posizionare le pinze aperte intorno uno dei ippocampi. Chiudere la pinza sul fondo dell'ippocampo quindi rimuoverla, recuperando il più possibile. Ripetere la procedura per il secondo ippocampo.
    5. Posizionare le pinze aperte sotto uno dei striata e separare delicatamente dal cervello. Utilizzare le pinze per rimuovere ogni residuo corteccia dallo striato. Ripetere questa procedura per il secondo striato.
    6. Utilizzare le pinze per deprimere delicatamente da 2 mm, il contorno del cervelletto per facilitare la separazione del cervelletto dal cervello. Posizionare le pinze appena dietro il cervelletto e toglierlo muovendo la pinza in avanti.
    7. Utilizzare l'ampia parte della pinza per sollevare il mesencefalo per vedere chiaramente dove si unisce al tronco cerebrale. Effettuare una incisione verticale all'incrocio quindi rimuovere il tronco cerebrale.
    8. Posizionare le pinze dietro il mesencefalo, che hos composta da quattro strutture arrotondati. Incidere verticalmente fino mesencefalo è stato completamente separato dal cervello rimanente.
  2. Preparare omogenati di variabile% (peso / volume) in tampone HS, a seconda della quantità di tessuti disponibili, cioè, 5% omogenato per un peso compreso tra 10 e 30 mg, 10% per un peso compreso tra 30 e 80 mg, e 20% per un peso superiore a 80 mg.
    1. Aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni del cervello sezionati per ottenere l'atteso% dell'omogeneizzato.
    2. Vortex e controllare che i tessuti sono completamente immersi nel buffer HS.
    3. Omogeneizzare campioni preparati dalle regioni cerebrali sezionati o del midollo spinale cervicale con una smerigliatrice tessuto composto da un tubo di vetro borosilicato e due pestelli, A e B.
    4. Versare ciascuna regione del cervello di essere schiacciato direttamente nel tubo. Inserire pestello A nella provetta e ritrarlo. Ripetere il movimento circa dieci volte di dissociare il tessuto. Quindi utilizzare pestello B a continue molatura il tessuto con altri 20 movimenti. Trasferire le omogenati in una provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml.
  3. Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C per eliminare eventuali frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, li suddividere in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA.

4. Individuazione di αS con metodo ELISA

  1. Diluire anticorpi di copertura di 0,01 ng / ml. Utilizzare policlonale di coniglio anti-αS o monoclonale clone 42 anticorpo in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 tampone (pH 9,6).
  2. Rivestire la 96 pozzetti con 100 pl per pozzetto di questa soluzione di rivestimento, e lasciare a 4 ° CO / N. Utilizzare l'anticorpo policlonale di coniglio anti-αS nella soluzione di rivestimento per l'ELISA utilizzando anticorpi di rilevamento syn514, clonare 42, LB509, AS11, 4D6 e 8a5. Usare l'anti-αS anticorpo monoclonale clone 42 come una soluzione di rivestimentoin combinazione con anticorpo di rilevazione anti-pSer129 αS.
    NOTA: Se necessario, le piastre possono essere conservati a 4 ° C per una settimana prima della ELISA viene eseguita.
  3. Utilizzare una rondella piatto per lavare i piatti per cinque volte con 300 ml di PBS con 0,05% di Tween 20 (PBST) per pozzetto. Da questo punto in poi, l'incubazione è a RT.
  4. Aggiungere 200 ml di T20 PBS tampone di bloccaggio per pozzetto. Agitare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
  5. Diluire le omogenati di cervello (diluizione 1: 100 del omogenati 20%, 1:50 del 10% omogenati e 1:25 delle omogenati 5% in PBST BSA 1%), e aggiungere 100 ml di ogni bene. Poi incubare per 2 ore agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
  6. Aggiungere i diversi anticorpi di rilevamento αS in PBST con BSA 1% alle diluizioni indicate nella lista dei materiali. Incubare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
  7. Aggiungi sia contro-mouse o anti-coniglio coniugati IgG HRP diluito 1: 8.000 in PBST integrato con BSA 1% per 1 ora agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST.
  8. Aggiungere 100 ml di 3,3 ', soluzione 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti al buio agitando a 150 rpm.
  9. Arrestare la reazione aggiungendo 100 ml di HC1 per bene poi misurare l'assorbanza a 450 nm con il lettore per micropiastre.
  10. Per l'analisi dei dati, sottrarre il valore di assorbanza ottenuto in un pozzo con tutti i reagenti tranne i campioni di cervello di topo (Bianco) dai valori OD misurati per ciascuno dei campioni analizzati.

5. epitopi Mapping

  1. Eseguire la mappatura epitopi secondo il metodo descritto da Osman 16. In breve, i peptidi del punto della sequenza α-sinucleina umana contenente 12 aminoacidi su nitrocellulosa con 10 amminoacidi che si sovrappongono.
  2. Blocco con 50 mM Tris / NaCl 150 mM tampone pH 10 contenente 0,05% di Tween 20 e 5% di latte in polvere. Incubare l'anticorpo nel bloccare soluzione ad una concentrazione di 2 mg per ml dell'anticorpo a 2-10 ° CO / N.
  3. Lavare la membrana tre volte con 50 mM Tris / 150 NaCl mM tampone pH 10 contenente lo 0,05% di Tween 20. Incubare con la capra coniugato anti-topo IgG HRP. Lavare la membrana altre cinque volte usando lo stesso tampone poi macchia con un kit di colorazione macchia TMB occidentale.

6. Analisi statistica

  1. Utilizzare il pacchetto software R e nlme effettuare effetti misti regressioni per modellare OD. Per ogni confronto, eseguire un modello di regressione effetto misto. Utilizzare un effetto fisso per distinguere sintomatica da gruppi asintomatici.
  2. Utilizzare un effetto casuale per riflettere le variazioni di ripetizioni per un dato mouse. Controllare omoschedasticità esaminando i residui e, se necessario, utilizzare le funzioni di varianza per modellare la struttura della varianza degli errori all'interno del gruppo in linea con Pinheiro e Bates 1Impostare 0,05 come soglia di significatività P. 7.

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Risultati

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In questo studio, i test ELISA utilizzate specificatamente identificati associata a malattia αS (αS D) in omogenati di cervello preparate in un buffer Alta sale da malati topi M83. Utilizzando un anticorpo che riconosce specificamente pSer129 αS (p = 0,0074), ELISA distingue facilmente vecchi, topi malati (> 8 mesi) da giovani (2-5 mesi), i topi sani M83 (Figura 1). Molti altri anticorpi hanno mostrato segnali altrettanto elevati (> 0,6 OD) solo in omogenati di cervello di topi malati. ...

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Discussione

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L'uso di un ELISA è stato dimostrato per rilevare specificamente αS D direttamente da omogenati di cervello mouse durante la malattia nel modello di topo transgenico M83. In effetti, questo ELISA potrebbe facilmente distinguere malati topi M83 da topi sani M83 utilizzando solo intere omogenati di cervello in tampone alta Salt.

Le fasi più critiche per ottenere risultati di successo che utilizzano questo ELISA sono: dissezione correttamente le diverse regioni del cervello di to...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi in conflitto da dichiarare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Damien Gaillard per vaccinazioni e il follow-up di esperimenti sugli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da ANSES (Agenzia francese per l'Alimentazione, Ambiente e Salute e Sicurezza), e da una sovvenzione della Fondazione Parkinson Francia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LB509Abcamab27766Detection antibody 1/2,000
AS11Produced at AnsesDetection antibody 1/1,000
4D6Abcamab1903Detection antibody 1/2,000
PSer129Abcamab59264Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Detection antibody 1/1,000
syn514Abcamab24717Detection antibody 1/500
clone 42BD Biosciences610787Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonDetection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PCoating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferAdjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAdjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150x concentrated
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10x concentrated
TMBSigmaT0440Used for ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Used for epitope mapping
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120keep on ice at this step
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-10628X magnification
Forceps Dumont#7WPI14097For dissection steps
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290

Riferimenti

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