L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Sommario

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

Abstract

Il pesce zebra è diventato un organismo modello molto importante per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, della fisiologia, delle malattie e della rigenerazione dei tessuti. Una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede strumenti sperimentali che consentano la manipolazione inducibile e tessuto-specifica dell'espressione genica o delle vie di segnalazione. Pertanto, noi e altri abbiamo recentemente adattato il sistema TetON per l'uso nel pesce zebra. Il sistema TetON facilita l'espressione genica controllata temporalmente e spazialmente e abbiamo recentemente utilizzato questo strumento per sondare le funzioni tessuto-specifiche della segnalazione Wnt/beta-catenina durante la rigenerazione della pinna caudale del pesce zebra. Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere un'espressione genica inducibile e tessuto-specifica nella pinna caudale adulta che si rigenera di pesce zebra. Ciò include la generazione di linee transgeniche stabili TetActivator e TetResponder, l'induzione transgenica e le tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nella pinna rigenerata. Pertanto, questo protocollo funge da modello per la creazione di un sistema TetON funzionale nel pesce zebra e il suo successivo utilizzo, in particolare per lo studio della rigenerazione delle pinne.

Introduzione

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell'espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi.

At....

Protocollo

1. Generazione di transgeniche TetActivator pesce Lines

1. Generazione di TetActivator costrutto
   1. Clone sequenze regolatrici di interesse monte della cassetta TetActivator nel vettore # 1247 utilizzando tecniche standard. In alternativa, utilizzare tecniche di ricombinazione per generare un BAC, in cui la cassetta TetActivator (vector # 1180) è inserito nel primo esone del gene bersaglio, e dove il Tol2 invertita ripetizioni sono introdotti nel backbone BAC (per un protocollo recombineering dettagliata vedere ^7,8).
   2. Preparare tossina-libero plasmide DNA o preparazioni di DNA BAC utilizzando kit disponibili in commercio.
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Risultati

Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l'espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi se.......

Discussione

Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un'analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l'espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizzat.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Scatole di allevamento	Aqua Schwarz	AquaBox 1
Microscopio a fluorescenza composta	, ad es. Leica, Zeiss	varia a seconda del produttore	per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti
Microscopio confocale	, ad es. Leica, Zeiss	varia a seconda del produttore	per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti
Criostato	, ad es. Leica, Thermo-Scientific	varia a seconda del produttore	per criosezione
4', 6- diamidino-2-fenilinodele (Dapi)	Sigma-Aldrich	D9542	utilizzare 1/5.000 in PBS per la visualizzazione dei nuclei
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891	preparare scorte in 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) per TetResponder
induzione Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	4% (p/v) di paraformaldeide in PBS, pH 7,5 per la fissazione
1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)			1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5
1x Soluzione salina tampone fosfato + Tween 20 (PBT)			1x PBS con 0,1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus vetrini per microscopio ad adesione	Thermo Scientific	1014356190	per la raccolta di sezioni di tessuto
Microscopio a stereofluorescenza	, ad esempio Leica, Zeiss,	varia a seconda del produttore per la	genotipizzazione basata sulla fluorescenza
Termociclatore	, ad esempio Biorad, Applied Biosystems	varia a seconda del produttore	per la genotipizzazione basata su PCR
Mezzo di congelamento dei tessuti (TFM)	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	per l'inclusione di tessuti campioni
Tricaina (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	per anestesia utilizzare a 1 mg/ml in terreno embrionale E3