Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Lukasz J. Ochyl; James J Moon

doi:10.3791/52771

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Articolo metodologico

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

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DOI:

10.3791/52771

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29 aprile 2015

Lukasz J. Ochyl¹^,² , James J Moon¹^,²^,³

¹Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, ²Biointerfaces Institute, University of Michigan, ³Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

In questo articolo

Sommario

Descriviamo tecniche basate sull'imaging di animali interi e citometria a flusso per monitorare l'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche in risposta all'immunizzazione con nanoparticelle in un modello murino di vaccinazione.

Abstract

Gli adiuvanti tradizionali dei vaccini, come l'allume, suscitano risposte subottimali delle cellule T CD8+. Per affrontare questa importante sfida nello sviluppo di vaccini, vari sistemi di nanoparticelle sono stati ingegnerizzati per imitare le caratteristiche dei patogeni per migliorare la consegna dell'antigene ai linfonodi drenanti e aumentare l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule presentanti l'antigene, portando a nuove formulazioni di vaccini ottimizzate per l'induzione di risposte delle cellule T CD8+ specifiche per l'antigene. In questo articolo, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle "che imita i patogeni", chiamato vescicole multilamellari reticolate interbistrato (ICMV) che può fungere da efficace vettore di vaccini per la co-somministrazione di antigeni di subunità e agenti immunostimolatori e l'elicitazione di potenti risposte citotossiche dei linfociti T CD8+ (CTL). Descriviamo i metodi per caratterizzare le dimensioni idrodinamiche e la carica superficiale delle nanoparticelle di vaccino con diffusione dinamica della luce e analizzatore di potenziale zeta e presentiamo una procedura basata sulla microscopia confocale per analizzare la somministrazione di antigene mediata da nanoparticelle ai linfonodi drenanti. Inoltre, mostriamo una nuova tecnica di imaging a bioluminescenza di interi animali che utilizza il trasferimento adottivo di cellule T CD8+ antigene-specifiche che esprimono luciferasi in topi riceventi, seguito dalla vaccinazione con nanoparticelle, che consente l'interrogazione non invasiva dei modelli di espansione e traffico di CTL in tempo reale. Descriviamo anche la colorazione dei tetrameri e l'analisi citofluorimetrica delle cellule mononucleate del sangue periferico per la quantificazione longitudinale delle risposte endogene delle cellule T nei topi vaccinati con nanoparticelle.

Introduzione

Sviluppo di un vaccino tradizionale è principalmente impiegato l'approccio empirico di tentativi ed errori. Tuttavia, con il recente sviluppo di una vasta gamma di biomateriali e scoperta di determinanti molecolari di attivazione immunitaria, è ora possibile progettare razionalmente formulazioni di vaccino con spunti biofisici e biochimici derivati da agenti patogeni ^1,2. In particolare, diverse piattaforme di distribuzione di droga di particolato sono stati esaminati come portatori di vaccini in quanto possono essere co-caricati con antigeni subunità e agenti immunostimolanti, proteggere i componenti del vaccino dal degrado, e migliorare la loro co-....