Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare Plasmodium Rhoptry Proteine

Summary

Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry.

Abstract

La malaria causa una significativa morbilità e mortalità globale. Nessun vaccino di routine è attualmente disponibile. Uno dei motivi principali per la mancanza di un vaccino è la sfida di identificare idonei vaccini candidati. Proteine ​​malariche espressi utilizzando sistemi di espressione cellulari basati procariote ed eucariote sono scarsamente glicosilate, generalmente insolubile e sottoposti pieghevole improprio con conseguente riduzione della immunogenicità. I sistemi di espressione libere di germe di grano, reticolociti di coniglio lisato ed Escherichia coli lisato sono attualmente utilizzati per l'espressione di proteine ​​della malaria. Tuttavia, la lunghezza del tempo di espressione e glicosilazione impropria di proteine ​​rimane ancora una sfida. Dimostriamo espressione di proteine ​​Plasmodium in vitro utilizzando sistemi di espressione libera cellulari basato HeLa, denominati "sistemi in vitro di cellule umane libera espressione". I sistemi di espressione cell free basato 2 HeLa trascrivere mRNA in 75 minuti e 3 ml di transcribed mRNA è sufficiente la traduzione proteine ​​in 90 min. Il sistema di espressione 1-passo è una trascrizione e traduzione sistema di espressione accoppiato; la trascrizione e co-traslazione avviene in 3 ore. Il processo può anche essere esteso per 6 ore fornendo energia supplementare. Nel sistema di espressione 2-passo, viene prima mRNA trascritto e quindi aggiunto alla miscela di traduzione per l'espressione della proteina. Descriviamo come esprimere le proteine ​​della malaria; una idrofobica Cleft di PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembrana (PFMC-2TM) di proteine, una proteina PF3D7_0925900 idrofila e un armadillo ripete contenenti proteine ​​PF3D7_1361800, utilizzando il sistema di espressione delle cellule HeLa base. Le proteine ​​sono espresse nelle micro volumi impiegando strategie di espressione 2-step e 1-step. Un metodo di purificazione di affinità per purificare 25 ml di proteine ​​espresse utilizzando il sistema di libera espressione in vitro delle cellule umane è anche descritto. Resa di proteine ​​è determinato mediante saggio di Bradford e l'espressoe proteine ​​purificate possono essere confermati da analisi di western blotting. Proteine ​​ricombinanti espresse possono essere utilizzati per vaccinazioni, test immunologici e proteine ​​sequenziamento.

Introduction

Nella ricerca la malaria, l'espressione delle proteine ​​immunogeniche utilizzano sistemi basati cellula procariote o eucariote rimane una sfida. La ricchezza AT del genoma Plasmodium e sconosciute meccanismi posta traslazionali ^14,7, contribuiscono alle difficoltà connesse con l'ottenimento di proteine ​​correttamente giunte e immunogenico per gli studi di produzione di anticorpi e vaccini. Sistemi procariotici quali Escherichia coli sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante. Sistemi procariotiche sono a basso costo, efficace, producono alte rese di proteina ricombinante e hanno più vettori di clonazione. Host E. coli sono facili da trasformare e cellule crescono rapidamente. Tuttavia, i sistemi procarioti hanno delle limitazioni come la mancanza di sostituzione aminoacidica, modificazione post-traslazionale, rischio di contaminazione, prodotti eterogenei e l'accumulo di proteine ​​ricombinanti in corpi di inclusione ^24.

In unstudio di Mehlin et al. (2006), sono stati espressi 1000 fotogrammi di lettura aperta (ORF). Circa il 7% delle proteine ​​espresse erano solubile ^14. L'insolubilità osservata è dovuta alla natura di parte dei geni e l'alta frequenza di codoni che sono idealmente utilizzato dal Plasmodium AT ricca genoma ^14. Una strategia alternativa per superare questo problema è stato sviluppato usando plasmidi o cellule ospiti contenenti tRNA che riconoscono codoni rare o codoni che corrispondono alle frequenze ^3. Anche dopo l'esecuzione di queste ottimizzazioni, molto piccole porzioni di proteine ​​sono espresse come solubili, attiva e immunogenico ^14. I sistemi di espressione cell-free contengono tutti i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, come ribosomi, fattori di inizio, fattori di allungamento (fattori traduzioni), tRNA e aminoacil-tRNA sintetasi. Entrambe le reazioni di trascrizione e traduzione sono accoppiati in procedimento a passo ^11,29. Il transcrireazione ption viene eseguita in un tubo prima quantità appropriata di mRNA viene incubato con macchinari traduzione in un'altra ^11,29 tubo. Sebbene questi metodi sono efficaci nel Plasmodium sp. Espressione della proteina, un grave inconveniente è la lunghezza di tempo per l'espressione della proteina, che è di circa 22 ore ^29. Inoltre, l'alto costo delle forniture per l'inclusione nei protocolli ^29, i preparativi alta intensità di lavoro del lisato cellulare e incongruenze nelle preparazioni dei componenti, rendono questi sistemi irraggiungibile. L'obiettivo principale dei ricercatori per lo sviluppo di un sistema di libera espressione delle cellule dipende da fattori come la modificazione genetica rapida, rese veloci con alte concentrazioni e diritte preparati lisato avanti ^1.

Sistemi eucarioti come il lievito, linee cellulari di mammiferi, baculovirus sistema di espressione mediata, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemi di espressione parassitarie such come Leishmania sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante ^7. Sistemi eucarioti condividono relazione filogenetica e quindi condividono anche caratteristiche come la glicosilazione, acilazione, formazione di legami disolfuro, interazione chaperone, proteolisi e compartimentalizzazione sub-cellulare. Proteine ​​eventi secrezione in eucarioti prevengono l'accumulo e diminuisce la tossicità per sistemi di espressione ^13. L'uso di sistemi di lievito è preferito come sono adatti per l'espressione di proteine ​​in larga scala e per ottenere alte rese ^4. Due P. falciparum proteine ​​PFCP-29 e Pvs25 sono state prodotte utilizzando il sistema di lievito ^4. Tuttavia, un grave inconveniente nella sintesi della maggior parte delle proteine ​​era N e O-glicosilazione pattern irregolari, pieghevole improprio e troncamento di proteine ​​dalla loro forma nativa ^4.

L'uso di cellule di mammifero per la sintesi delle proteine ​​ricombinanti è laboriosa ed è expenSIVE di mantenere stabili linee cellulari ricombinanti ^4. Pertanto, le cellule di mammifero sono stati limitati per l'analisi di proteine ​​di segnalazione, interazioni proteina e interazioni parassita-ospite e anche per testare vaccini DNA ^4. Il DNA umano e in vitro sistema privo di cellule mRNA in espressione della proteina qui descritto è un sistema basato su mammiferi HeLa derivato dalle cellule che esprime proteine ​​in 3 ore. Proteine ​​espresse utilizzando pT7CFE1-Chis vettore di espressione hanno un tag C-terminale facilitare l'identificazione e la purificazione. Il sistema basato HeLa è completato con i fattori di inizio della traduzione e un regolatore di traduzione, migliorando così l'efficienza del sistema di traduzione. Le proteine ​​possono essere rapidamente tradotti, vagliati, verificati ed elaborati per l'utilizzo in diverse applicazioni immunologici e strutturali ^15.

Sistemi di espressione senza cellule eucariotiche come germe di grano e reticolociti di coniglio sono attualmente utilizzati per l'espressione di varproteine ​​eucariotiche ious compreso Plasmodium proteine ^​​11,29. Inoltre, E. sistemi acellulari basate coli sono anche impiegati per l'espressione della proteina eucariotica ^11. Tabella 1 riassume diversi sistemi di espressione di cellule libera confrontando caratteristiche dei sistemi, nonché la facilità di utilizzo dei sistemi per l'espressione della proteina. Il sistema privo di cellule umane in confronto agli altri ha la capacità di eseguire postali e co-traslazionale modificazioni ed è meno costoso. Ottimizzazione Codon è possibile e tutte le reazioni possono essere eseguite in 3 ore. Il sistema HeLa è un sistema di traduzione ideale per la sintesi proteica in ambiente di laboratorio.

Uno dei principali vantaggi di sistemi di espressione di cellule umane libera rispetto ad altri sistemi cell free è la disponibilità di diverse linee cellulari derivate da diversi diversi organi e tessuti. Diverse varietà di sistemi liberi di cellule possono essere progettati in funzione della linea cellulare. L'estrattos derivate dalle cellule dei mammiferi hanno una maggiore efficienza di sintetizzare proteine ​​di grandi dimensioni di tutti gli altri sistemi di espressione delle cellule gratuito. Questi sistemi cella libera espressione possono essere utilizzate anche in applicazioni diagnostiche e caratterizzazione di proteine ​​come microarray ^30. Le linee popolari cellule HeLa sono più ampiamente utilizzati per effettuare l'espressione di proteine ^​​33. Il reticolo endoplasmatico in linee cellulari HeLa è sottosviluppati, portando alla mancanza di attività di modifica glicosilazione post-traduzionale ^33. Tuttavia, questo sistema è ritenuto vantaggioso per Plasmodium sintesi proteica come Plasmodium manca anche traduzione modifica glicosilazione alberino ^29. La libera protocollo di trascrizione-traduzione cellule HeLa è facile da eseguire, poco costoso e proteine ​​può essere espresso in 90 min, pronta per la purificazione e altre applicazioni a valle.

Protocol

1. Preparazione di Parasite colture cellulari, Collezione di Parasite Pellet

1. Preparare supporti RPMI-1640-HEPES aggiungendo 10 g di polvere RPMI-1640, 66 mg di solfato di gentamicina, 2 g di bicarbonato di sodio, 5,9 g tampone HEPES, 50 mg ipoxantina e 3,8 g di destrosio in 1 L dH sterile ₂ O. Miscelare con tavolo agitatore magnetico fino a quando tutte le dissolve polvere in 1 l di acqua distillata. Eseguire micro filtrazione di media utilizzando 0,22 micron filtro. Conservare il supporto in bottiglie sterili.
2. Lavare non infetti (fresco) di tipo A + eritrociti utilizzando RPMI. Preparare il 5% di ematocrito di eritrociti (0,5 ml di eritrociti freschi lavati in 9,5 ml al 10% RPMI siero umano +).
3. Fai siero 15% umano + RPMI (15 ml di siero umano e 85 ml di RPMI) per avviare la coltivazione di parassiti. Crea siero umano 10% e RPMI (10 ml di siero umano e 90 ml di RPMI) per continuare coltura di parassiti nei globuli rossi.
4. Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 ceppi) in tipoA + eritrociti umani a 5% ematocrito e il 20% parassitemia in capsula di Petri o un pallone da 75 centimetri ^{a 3} cultura. Mantenere coltura in vitro secondo il metodo di Trager e Jensen candela vaso ^26. In alternativa, mantengono culture sono in incubatore a 37 ° C mantenendo 9,5% di CO ₂ e 3,4% N ₂ gas. Cultura P. falciparum in RPMI 1640 HEPES multimediale integrato con siero umano 10%.
5. Sincronizzare P. falciparum cultura aggiungendo 65% Percoll (65 ml di Percoll + 35 ml di RPMI-1640 senza siero umano) alla coltura concentrato ^27.
6. Centrifugare il concentrato di cultura con Percoll a 2500 xg per 5 minuti che si traduce in 3 strati. Con attenzione, utilizzando una pipetta di trasferimento isolare schizonti dal mezzo di trasferimento in un tubo livello separato in condizioni asettiche ^27.
7. Lavare le culture isolate con siero umano 10% + RPMI-1640 due volte per rimuovere l'eccesso di Percoll per centrifugazione a 7500 xg per 5 min. Discard il surnatante ogni volta in condizioni asettiche ^27.
8. Continuare coltura P. sincronizzato schizonti falciparum nel siero umano 10% + RPMI-1640 ^27.
9. Raccogliere schizonti trattando Plasmodium eritrociti -infected con 10 mM Tris pH 8.8 e centrifugazione a 15000 xg per 15 minuti ^23. Pellets Conservare parassita a -70 ° C dopo l'aggiunta di 5 ml di inibitore della proteasi (aprotinina) al pellet. Utilizzare pellet parassita per l'estrazione di proteine, isolamento DNA genomico e l'isolamento di RNA.

2. Preparazione plasmide vettore

1. Isolare DNA genomico da P. pellets schizonte falciparum preparate da colture di circa il 20% parassitemia.
2. Aggiungere 600 ml di 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS e 1 mg / ml proteinasi K, in pellets in una provetta, omogeneizzare pellet usando una siringa da 1 ml collegata ad un ago 26 G. Alternate riempire la siringacon la miscela pellet e svuotamento in una provetta 20 volte. Incubare provetta contenente omogeneizzato O / N in un bagno a 50 ° C Acque.
3. Eseguire fenolo - cloroformio (P + C) estrazione aggiungendo 600 ml di P + C (300 ml di fenolo e 300 ml di cloroformio) a pellet omogeneizzato. Tubo tappo e agitare la miscela vigorosamente invertendo end-to-end del tubo. Provetta da centrifuga a 14000 xg per 2 minuti e raccogliere soluzione acquosa superiore utilizzando una micropipetta in una nuova provetta. Ripetere questa operazione due volte.
4. Aggiungere 600 ml di cloroformio per lo strato acquoso nel nuovo tubo dal punto 2.1.2. Agitare la provetta per 10 sec e centrifugare a 14.000 xg per 2 min. Misurare la fase acquosa superiore con una micropipetta e trasferirlo ad una nuova provetta.
5. Aggiungere 0,1 vol 5 M di sodio acetato pH 5,5 e 1 vol di isopropanolo (se strato acquoso è 300 ml aggiungere 30 ml di 5 M di sodio acetato pH 5.5 + 330 ml di isopropanolo) per laici acquosaer dal punto 2.1.3. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 15 min.
6. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 10 minuti per precipitare pellet di DNA. Eliminare il supernatante e lavare pellet con 100 ml di etanolo al 70% (70 ml di etanolo e 30 ml di dH ₂ O) per eliminare il sale in eccesso dal DNA. Conservare il DNA in 50 ml di dH ₂ O a -20 ° C.
7. Progettare avanti e indietro primer utilizzando il software o manualmente per l'amplificazione di P. geni falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 precedentemente identificati in studi proteoma ^16,18 con opportuni siti di restrizione per permettere la clonazione delle sequenze geniche nelle più siti di clonazione di espressione plasmide pT7CFE1-Chis, come illustrato nella tabella 2.
8. Fare un 50 microlitri miscela di reazione con l'aggiunta; 5 ml di isolato P. falciparum DNA genomico, 5 ml di 10x tampone, 5μl di MgCl _2, 1,5 ml di primer forward, 1,5 microlitri diprimer reverse, 0,5 ml di DNA polimerasi T7 e 31,5 ml di dH ₂ O e effettuare la reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 ° C per 8 min per denaturazione, 50 ° C per 1 minuto e 30 secondi per l'estensione e 72 ° C per 9 min per la ricottura e rinaturazione per amplificare i geni mostrati nella Tabella 1.
9. I prodotti di PCR separate sulle 1% gel di agarosio (1 g di agarosio e 100 ml di acetato di Tris EDTA (TAE) buffer) ^32.
10. Tagliare le bande di DNA PCR amplificati dal gel di agarosio, disporre le fette di gel contenenti DNA in una colonna di estrazione centrifuga DNA gel e congelare a -20 ° C per 5 min. Aggiungere 100 ml di isopropanolo per le fette di gel ghiacciato e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
11. Misurare il flusso continuo acquosa filtrato nel tubo di raccolta dal punto 2.5, usando una micropipetta e trasferire in una nuova provetta. Aggiungere 0,1 vol 5 M di acetato di sodio e centrifugare a 14.000 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e aggiungere 10 ml di dH ₂ O a the pellet di DNA.
12. Digerire il vettore di espressione pT7CFE1-Chis e frammenti di DNA purificato (da 2,6) in due tubi separati con l'aggiunta di 3 ml di plasmide e 5 ml di prodotti genici PCR per ogni tubo. Aggiungere a ogni provetta, 1 ml di specifici enzimi di restrizione, 2 ml di tampone di reazione e 14 ml di dH ₂ O.
13. Aggiungere 3 ml di plasmide digerito, 5 ml di frammenti di DNA digerito, 2 ml di 10x tampone ligasi, 1 ml di ligasi e 9 ml di dH ₂ O in una provetta. Incubare a 12 ° CO / N.
14. Aggiungere 0,1 vol di 3 M acetato di sodio, con pH 5,5 e 2 volumi di etanolo (se il volume di tubi legatura è di 20 ml aggiungono 2 ml di acetato di 3 M di sodio + 44 ml di etanolo) per il tubo dal punto 2.14. Mescolare bene e incubare a -20 ° C per 15 min.
15. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante con una micro pipetta senza disturbare il pellet.
16. Aggiungere 100 ml di etanolo al 70% to il pellet dal punto 2.10. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 5 min. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per il pellet di DNA.

3. Proteina espressione utilizzando in vitro Cellula umana Free Expression Sistema

1. Preparare 20 ml di miscela di trascrizione misurando 2 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 4 ml di tampone 5x trascrizione, 4 ml di mix NTP, 2 ml di T7 RNA polimerasi e 8 ml di acqua priva di nucleasi per 2-step umana in vitro espressione della proteina utilizzando i modelli di DNA. Mescolare componenti in una provetta e incubare per 75 min a 30 ° C in un bagno d'acqua.
2. Take 2 microlitri della miscela trascrizione e aggiungerlo a 23 ul di miscela di traduzione contenente 12,5 ml di lisato cellulare HeLa, 2,5 ml di proteine ​​accessorie, 1 ml di soluzione salina A, 0,5 ml di aminoacidi -met, 0,5 ml di aminoacidi -Leu, 181; l di inibitore RNAse, 1,25 ml di mix energetico e 3,75 ml di acqua priva di nucleasi.
3. Incubare la miscela traduzione da passo 3,2 a 30 ° C per 90 min. Conservare i prodotti tradotti a -20 ° C.
4. Preparare 25 ml di trascrizione e traduzione miscela con l'aggiunta di 3 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 2 ml di acqua priva di nucleasi, 5 ml di mix di reazione, 12,5 ml di HeLa lisato e 2,5 ml di proteine ​​accessorie per 1-step Umana Accoppiato Expression IVT proteine ​​per i modelli di DNA.
5. Incubare la miscela di reazione proveniente dal passaggio 3.4 per 90 min per 6 ore a 30 ° C. Conservare i prodotti di traduzione a -20 ° C.

4. Purificazione di proteine ​​ricombinanti Espressi

1. Aggiungere 75 ml di tampone purificazione 1x a 25 ml di prodotto di traduzione di fare 100 ml di miscela di purificazione.
2. Aggiungere 100 ml di resina nichel chelante a 100 ml di mixt depurazioneUre. Wash Ni-resina per due volte con l'aggiunta di 300 ml di dH ₂ O e 300 ml di buffer di legame. Risospendere resina e centrifugare a 14000 g per 1 minuto per rimuovere l'eccesso di etanolo.
3. Aggiungere 100 ml di miscela di purificazione dal punto 4,2-100 ml di nichel resina chelante e incubare la miscela per 60 minuti a temperatura ambiente.
4. Centrifugare la miscela a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo etichettato come "flusso attraverso".
5. Resina Lavare con 100 ml di tampone di lavaggio 1x (imidazolo 20 mm, 250 mm NaH ₂ PO ₄ a pH 8, 2.5 M NaCl e DH ₂ O). Centrifugare a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in provetta con l'etichetta "lavare". Ripetere il punto 4.5 due volte.
6. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione 1x (imidazolo 100 mM, 250 mM Na ₂ PO ₄ a pH 8,0, 2,5 M NaCl e dH ₂ O) alla resina e incubare per 15 min. Centrifugare a 14000 g per 1 min. Fare il passo eluizione due volte. Ognitempo di raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga fresche e etichetta come "eluito".
7. Dopo l'eluizione, lavare resina due volte come descritto al punto 4.5. Conservare il flusso attraverso, lava e campioni di eluizione a -20 ° C o inferiore. Resina deve essere conservato a 4 ° C. Utilizzare 30 ml di ogni campione per SDS-PAGE e immunoblotting analisi.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay ³⁴

1. Preparare le soluzioni di livello di albumina sierica bovina (BSA) con la concentrazione di 20 mg / ml (mescolare 10 ml di BSA (2 mg / ml) e 90 ml di dH ₂ O), 40 mg / ml (mescolare 20 ml di BSA (2 mg / ml) e 80 ml ​​di dH ₂ O), 60 mg / ml (miscela 30 ml di BSA (2 mg / ml) e 70 ml di dH ₂ O), 80 mg / ml (mescolare 40 ml di BSA (2 mg / ml) e 60 ml di dH ₂ O), 100 pg / ml (miscela 50 ml di BSA (2 mg / ml) e 50 ml di dH ₂ O), 160 mg / ml (mescolare 80 ml ​​di BSA (2 mg / ml) e 20 ml di dH₂ O) e 200 pg / ml (100 ml di BSA (2 mg / ml).
2. Misura 5 ml di flusso attraverso, lava e campioni di eluato dal punto 4.7. Aggiungere 95 ml di dH ₂ O.
3. Aggiungere 5 ml di Coomassie blu reattivo alle miscele di passi 5.1 e 5.2. Coprire le provette con parafilm e vortex per 10 sec poi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
4. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD) a lunghezza d'onda di 650 nm per i tubi di proteine ​​dal punto 5.3. Concentrazione Plot vs. lettura OD per determinare le concentrazioni di proteine ^​​34.

6. Western Blotting

1. Aggiungere 5 ml di estratti schizonte da P. falciparum, 2 ml di Escherichia coli espresso ricombinanti Rhop-3 proteine ^​​31, 5 ml di proteine ​​ricombinanti espresse utilizzando 2-step e 1 fase in sistemi in vitro di espressione umana e 10 ml di prodotti proteina purificata con il metodo affinità per separare i tubi.
2. Aggiungere tampone campione elettroforesi contenente mercaptoetanolo ad ogni provetta per un volume finale di 20 microlitri di rendere campioni di proteine ​​solubilizzate. Far bollire i tubi per 2 minuti.
3. Caricare campioni di proteine ​​solubilizzate su 10% SDS-PAGE per separare le proteine.
4. Trasferire proteine ​​separate da SDS-PAGE gel su carta di nitrocellulosa (NCP) per electrophoresing a 35 mA di corrente per il gel in una camera di western blotting semi-secco per 2 ore.
5. Blocco PCN dopo il trasferimento con il 2% senza grassi del latte.
6. Incubare bloccato PCN con i seguenti anticorpi policlonali diluiti 1: 100 in 2% di latte per eseguire western blotting; anticorpi di coniglio # 676 ²¹ specifica per P. rhoptries merozoite falciparum, anticorpi murini ²⁰ specifici per P. yoelii e P. berghei rhoptries merozoite, antisieri # 685 specifici per la P. falciparum proteine ​​vacuole parassitoforo, SERA (serina ricca antigene) ²² e gli anticorpi specifici per la Maurer217; s proteina schisi PFMC-2TM ^28.
7. Incubare PCN anche in 1: 100 diluito normali controlli negativi del mouse e siero di coniglio e la cultura trascorso surnatante (SCS) dalle cellule di mieloma SP2.
8. Incubare PCN con anticorpi e di controllo a 4 ° C O / N.
9. Lavare PCN 4x con Blot tampone e incubare PCN con specie specifici anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluito 1: 1000 in 2% di latte.
10. Lavare PCN 4x con tampone Blot. Incubare lavato PCN con la soluzione di sviluppo del colore A + B (Soluzione A: aggiungere 50ml di 1x tampone Blot e 30 ml di H ₂ O _2; Soluzione B: aggiungere 10 ml di metanolo e 30 mg di 3-cloro-naftolo) per 30 min nel buio. Analizzare i risultati Western Blot colorimetricamente.

Results

Validazione delle proteine ​​ricombinanti espresse attraverso la reattività con anticorpi specifici è un primo passo importante nel confermare il corretto ripiegamento delle proteine ​​espresse. Proteine ​​ricombinanti malariche sono state espresse utilizzando un passo e due fasi in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. Le proteine ​​ricombinanti sono purificati metodo affinità Ni-chelante. Abbiamo poi utilizzato antisieri contro interi rhoptries merozoite in western blotting di SDS-PAGE proteine ​​ric...

Discussion

I passi per una proficua espressione di proteine ​​utilizzando due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane e di purificazione sono: 1) l'amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) la trascrizione di RNA a ³⁰ ° C; 3) definizione di proteina a 30 ° C in presenza di inibitore RNAse; 4) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 5) analizzare i risultati in Western Blot utilizzand...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di espressione libera di cellule umane in <> in vitro in 2 fasi	Thermo Fisher	88856	Fuori produzione. Conservare sempre a -80 °C. Non scongelare in acqua tiepida
Sistema di traslazione accoppiato a 1 passaggio in vitro	Thermo fischer	88860	Conservare sempre a -80 °C. Non scongelare in acqua calda
Sistema di purificazione ProBond	Invitrogen	K850-01	Conservare presso RT
Resina nichel-chelante Probond	Invitrogen	R801-01	Conservare a 4oC.
A + Negozio di banca	del sangue		del sangue umano a 4 °C.