Vengono presentati saggi ad alto rendimento che, in combinazione, forniscono strumenti eccellenti per quantificare il rilascio di NET dai neutrofili umani.
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Articolo metodologico
Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I granulociti neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue umano. I neutrofili sono i primi ad arrivare nel sito dell'infezione. I neutrofili hanno sviluppato diversi meccanismi antimicrobici tra cui la fagocitosi, la degranulazione e la formazione di trappole extracellulari dei neutrofili (NET). I NET sono costituiti da un'impalcatura di DNA decorata con istoni e diversi marcatori di granuli, tra cui la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila umana (HNE). Il rilascio di NET è un processo attivo che coinvolge cambiamenti morfologici caratteristici dei neutrofili che portano all'espulsione del loro DNA nello spazio extracellulare. I NET sono essenziali per combattere i microbi, ma il rilascio incontrollato di NET è stato associato a diversi disturbi. Per saperne di più sulla rilevanza clinica e sul meccanismo di formazione del NET, è necessario disporre di strumenti affidabili in grado di quantificare il NET.
Qui vengono presentati tre metodi in grado di valutare il rilascio di NET da neutrofili umani in vitro. Il primo è un test ad alto rendimento per misurare il rilascio di DNA extracellulare da neutrofili umani utilizzando un colorante legante il DNA impermeabile alla membrana. Inoltre, sono descritti altri due metodi in grado di quantificare la formazione di NET misurando i livelli di complessi MPO-DNA e HNE-DNA specifici per NET. Questi metodi basati su micropiastre in combinazione forniscono ottimi strumenti per studiare in modo efficiente il meccanismo e la regolazione della formazione di NET nei neutrofili umani.
Introduzione
NET è un nuovo meccanismo con cui i neutrofili combattono i patogeni. 1 Il nucleo dei NET è il DNA nucleare. 1 Questa rete di DNA è associata alle proteine dei granuli neutrofili e agli istoni. 1 La principale forma di formazione di NET richiede la morte dei neutrofili caratterizzata dalla decondensazione della cromatina, dalla scomparsa delle membrane granulari e nucleari, dalla traslocazione dei neutrofili elastasi al nucleo, dalla citrullinazione degli istoni e infine dalla fuoriuscita di NET basati sul DNA. numero arabo I NET intrappolano e uccidono un'ampia varietà di microbi e sono una parte essenziale del repertorio d....
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Protocollo
L'Institutional Review Board della Università della Georgia ha approvato lo studio soggetto umano per raccogliere sangue periferico di volontari sani (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 I volontari hanno firmato il modulo di consenso informato richiesto prima di prelievo di sangue. La ricerca svolta in questo articolo è in conformità con le linee guida etiche per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani della Dichiarazione di Helsinki.
1. Isolamento di neutrofili dal sangue periferico umano (Figura 1)
Nota: Ci sono diversi modi per isolare neutrofili dal sangue periferico. Il protocollo che segue fornisce una possibilità. Questo protocollo....
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Risultati
Le figure in questo manoscritto descrivono il metodo di isolamento dei neutrofili, procedure sperimentali, e presentano risultati rappresentativi con spiegazione di analisi dei dati. La Figura 1 mostra le fasi sequenziali di preparazione neutrofili umani. Questo protocollo rappresenta solo un modo possibile di isolamento dei neutrofili. Si produce grandi quantità di neutrofili in grado di rilasciare NET sulla stimolazione di riposo. La figura 2 mostra co.......
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Discussione
NET rappresentano un affascinante romanzo meccanismo attraverso il quale i neutrofili uccidere gli agenti patogeni. 1 Sebbene la letteratura di NET ha continuato ad ampliarsi nel corso degli ultimi dieci anni dalla loro scoperta, diverse questioni importanti relative al loro ruolo nella biologia, meccanismo e regolazione rimangono poco chiari. metodologia appropriata deve essere sviluppato per misurare NET, questo meccanismo antimicrobico molto singolare. Questo articolo vengono descritti metodi che possono e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Un ringraziamento speciale al personale del laboratorio del Centro Sanitario dell'Università della Georgia per il loro continuo supporto al nostro lavoro sull'isolamento dei neutrofili umani. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di avviamento del Dr. Rada fornito dall'Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca dell'UGA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elastasi neutrofila anti-umana Coniglio Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2.000x rivestito |
| Anti-mieloperossidasi Ab (Coniglio) | Millipore | 07-496 | 1:2.000x rivestito |
| DNasi-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µ g/ml utilizzato per la digestione |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2,5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Rilevamento della morte cellulare ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Spettrofotometro per micropiastre Eon | Biotek | ||
| Gen5 Software per micropiastre all-in-one | Biotek | (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0,2% concentrazione/volume finale |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Utilizzare 10 mM di concentrazione finale. |
| 1 M di glucosio | Sigma | Utilizzare 5 mM di concentrazione finale. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM finale usato |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Provette coniche 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Provette coniche 50 ml | Thermoscientific 339652 | ||
| Percoll (pH 8,5-9,5) | Sigma | P 1644 | Cloruro di sodio, Sigma, S7653-250G |
| Spettro destrano | D1004 | ||
| RPMI 1640 terreni | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 pozzetti piastra nera fondo trasparente | Costar | 3603 |
Riferimenti
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al.
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Ristampe e permessi
