Articolo metodologico

Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

DOI:

10.3791/52784

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10 maggio 2015

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

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Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.

Abstract

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Il sistema ubiquitina-proteasoma è stato recentemente coinvolto in diverse patologie, tra cui le malattie neurodegenerative e il cancro. Alla luce di questo, tecniche per studiare il meccanismo di regolazione di questo sistema sono essenziali per chiarire i processi cellulari e molecolari delle malattie summenzionate. L'uso di emoagglutinina derivante sonde ubiquitina delineate nel presente documento è uno strumento prezioso per lo studio di questo sistema. Dettagli Questo documento un metodo che consente all'utente di eseguire saggi che danno una visualizzazione diretta della deubiquitinating attività enzimatica. Enzimi Deubiquitinating controllano la degradazione del proteasoma e condividono un'omologia funzionale ai loro siti attivi, che permette all'utente di indagare l'attività di diversi enzimi in un test. Lisati sono ottenuti attraverso dolce rottura delle cellule meccanico e incubate con sito attivo sonde dirette. Enzimi funzionali sono contrassegnati con le sonde mentre enzimi inattivi rimangono non legato. Di corsaning questo test, l'utente ottiene informazioni sia l'attività e potenziale espressione di molteplici enzimi deubiquitinating in modo facile e veloce. Il metodo attuale è molto più efficiente rispetto all'utilizzo anticorpi individuali per i predetti cento enzimi deubiquitinating nella cellula umana.

Introduzione

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Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) serve come una delle principali vie di degradazione in cellule di mammifero. Substrati legati per la degradazione nel proteasoma sono covalentemente contrassegnati con polimeri di ubiquitina (Ub) 1. Prima che il substrato bersaglio entra proteasoma per la degradazione, l'etichetta poli-ubiquitina deve essere rimosso. Una classe di enzimi noti come deubiquitinating enzimi (dubs) è responsabile per la rimozione e il riciclaggio delle molecole di ubiquitina 2. E 'stato previsto dal genoma umano che ci sono quasi un centinaio dubs che lavorano nella cella 3. Con un gran numero di dubs che controllano processi cellulari Ub-mediate tale, lo studio di questi enzimi rappresenta una sfida in quanto le tecniche di mRNA non danno informazioni sull'attività e western blotting dà solo informazioni sui livelli di espressione.

L'uso di emoagglutinina influenzale (HA) tagged, Ub-derived sito diretto sonde attive permette una covalente modification dei dubs funzionali e quindi dà una visualizzazione diretta delle attività di questi enzimi in un Western Blot 4. Le sonde hanno un gruppo tiolo reattivo C-terminale che funge da substrato suicida per il sito attivo residuo di cisteina 5. Con queste sonde, è possibile studiare l'attività e potenziale espressione di molti DUBS sotto le due stati patologici e fisiologici della cellula.

Le variazioni di attività DUB sono stati implicati in una serie di condizioni patologiche come il Parkinson, l'Alzheimer, anemia e vari tipi di cancro 6-10. Questa tecnica fornisce un potente strumento per lo studio della malattia. In questo lavoro, mostriamo l'applicazione di questa tecnica in cellule HeLa e M17 che sono state lisate usando perline di vetro. Inoltre, si delineano come utilizzare questo metodo in campioni di tessuto del midollo spinale del mouse. Le informazioni ottenute da questa tecnica può essere usato come punto di partenza per l'identificazionebersagli terapeutici così come i modelli che stabiliscono per lo studio delle diverse condizioni di malattia. La vera utilità di questa tecnica risiede nella sua capacità di fornire informazioni su più dubs in un singolo dosaggio.

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Protocollo

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1. Lysis Buffer Preparazione

  1. Sciogliere il saccarosio in acqua deionizzata (DI) acqua per fare una soluzione stock 2 M. Filtrare una soluzione 2 M di saccarosio con un aspirapolvere azionato 0,22 micron fluoruro di polivinilidene (PVDF) filtro.
  2. Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 500 mm e conservare in condizioni anaerobiche. Sciogliere il cloruro di magnesio (MgCl 2) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 100 mm. Sciogliere adenosina trifosfato (ATP) disodio idrato in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 50 mm.
  3. Portare una soluzione Tris a pH 7,4 sciogliendo Trizma cloridrato in acqua deionizzata e regolazione del pH usando idrossido di sodio (NaOH).
  4. Combinare porzioni delle soluzioni madre in acqua deionizzata per fare un tampone di lisi con una concentrazione di saccarosio di 250 mM, una concentrazione di 1 mM DTT, una concentrazione MgCl 2 di 5 mM, una concentrazione di ATP di 1 mM e una concentrazione di 50 mM Tris . Ad esempio, miscelare 535,3 ml di Tris, 500 ml di MgCl 2, 1,25 ml di saccarosio, 20 l di DTT, 200 ml di ATP e 7,4947 ml di acqua deionizzata per fare 10 ml di tampone di lisi. Questo può essere usato per circa 20 esperimenti.

2. Le cellule in coltura per l'esperimento

  1. Rendere i media aliquotandolo 30 ml di DMEM + 10% di siero fetale bovino (FBS) in un tubo da 50 ml.
  2. Trasferire le cellule HeLa M17 o congelati dallo stoccaggio di azoto liquido a una piccola bicchiere con acqua tiepida.
  3. Trasferire le cellule per provetta conica da 50 ml. In primo luogo, aggiungere alcuni media per la fiala cella. Poi il trasferimento delle cellule risospese entro 5 secondi di scongelamento.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 450 xg per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule. Aggiungere 20 ml di media in un pallone T75.
  5. Rimuovere il supporto da parte delle cellule con aspirazione. Aggiungere 5 ml di mezzi freschi per il pellet e risospendere.
  6. Trasferire la sospensione 5 ml di cellule ai 20 ml di media nel pallone T75 e incubare a 37 ° C. Change media ogni 3 giorni.

3. La raccolta delle cellule

  1. Rimuovere il supporto tramite aspirazione, facendo attenzione a non toccare le cellule.
  2. Lavare le cellule con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere PBS con aspirazione.
  3. Aggiungere 3 ml di tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al pallone T75 e incubare a 37 ° C per 3 min.
  4. Aggiungere 6 ml di mezzi freschi al pallone e risospendere le cellule.
  5. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml e centrifugare a 290 xg per 5 minuti.
  6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di PBS. Battere delicatamente la parte inferiore del tubo per rompere il pellet. Centrifugare a 290 xg per 5 min.
  7. Ripetere il punto 3.6 a tre volte.
  8. Rimuovere PBS e risospendere le cellule in 1 ml di PBS fresco. Trasferire al tubo Eppendorf (1,5 ml). Spin a 290 g per 5 min.

4. cellulare Lysis

  1. Misurare il volume approssimativo del pellet usando una pipetta und pesare perline di vetro in una massa: rapporto in volume di 1: 1. Aggiungere il doppio del volume del pellet in tampone di lisi.
    Nota: Aggiungere il buffer prima di aggiungere le perle di vetro.
  2. Lisare le cellule nel tubo Eppendorf alla massima agitazione per 30 minuti a 4 ° C vortexando in una camera fredda.
  3. Brevemente Centrifugare a 200 xg per 30 secondi per risolvere le perline. Raccogliere il surnatante.
  4. Aggiungere lo stesso volume di perline di vetro come prima nel surnatante.
  5. Vortex nuovamente alla massima agitazione per 30 minuti a 4 ° C.
  6. Brevemente Centrifugare a 200 xg per 30 secondi per risolvere le perle di vetro. Raccogliere il surnatante.
  7. Centrifugare a 5.030 xg per 5 minuti per rimuovere i nuclei, membrane e cellule intatte. Raccogliere il supernatante, che è il lisato cellulare.

5. Tissue omogeneizzazione

  1. Fai una massa: volume di 1: 9 soluzione di tessuto del midollo spinale del mouse per tampone di lisi.
    Nota: Questo metodo è applicabile ad una varietà di differirecampioni di tessuto Ent.
  2. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un'impostazione del livello 2 sulla omogeneizzatore per 30 sec per garantire che non vi siano blocchi rimanenti.
  3. Spin down a 5.030 xg per 3 min per rimuovere i nuclei, membrane e le cellule intatte.
  4. Raccogliere il supernatante, che è il lisato.

6. Campione Derivatizzazione

  1. Eseguire un acido bicinconinico (BCA) in un'analisi piastra a 96 pozzetti per determinare la concentrazione di proteine ​​del lisato tissutale utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti colorimetrico come specificato dal protocollo del kit Protein Assay Pierce BCA.
  2. Portare una aliquota corrispondente a 20 mg di proteine ​​totali di 50 microlitri utilizzando (DI) acqua deionizzata.
  3. Aggiungere 2 ml di 1,35 mM di HA-Ub-Vinyl sulfone (VS) alla soluzione e incubare per 1 ora a 37 ° C. Ciò provoca 20 ug di lisato 50 nM di sonda nella miscela di reazione finale. Questo è in forte eccesso molare per assicurare la codifica di dubs funzionali.
  4. IOncubate il campione in tampone campione di Laemmli per 5 minuti a 95 ° C. Per un 52 microlitri reazione volumi uso 26 ml di tampone 2x campione, 13 ml di tampone campione 4x o 8,87 ml di tampone campione 6x.
  5. Raffreddare in ghiaccio prima di caricare il gel.

7. Western Blot

  1. Caricare un 12-pozzetti 4-20% gel tris-glicina con 40 ml di campione preparato
  2. Attivare il gel a 95 V finché il fronte ione raggiunge il fondo.
  3. Effettuare un trasferimento notturno del gel su un polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana.
  4. Incubare la membrana nel ammidico macchia nera e scansire il membane per ottenere un'immagine che mostra la quantità di proteina in ogni corsia.
  5. Decolorare la membrana e incubare 5% di latte in PBS per 1 ora per bloccare.
  6. Incubare la membrana nella anticorpo anti-HA primario in una concentrazione di 1: 10.000 in 5% di latte in PBS o notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
  7. Effettuare 3 lavaggi fo 5 min ciascuna in PBS con 0,1% di Tween-20 detergente.
  8. Incubare la membrana in una perossidasi di rafano topo ad una concentrazione di 1: 10.000 in 5% di latte in PBS per almeno 2 ore.
  9. Effettuare 3 lavaggi per 5 minuti ciascuna in PBS con 0,1% Tween-20 detergente.
  10. Eseguire 1 lavaggio per 5 min in PBS.
  11. Incubare la membrana in un reagente di rilevamento chemiluminescente per 10 min e rilevare utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Utilizzare l'impostazione sul rivelatore di esposizione automatica.

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Risultati

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Cellule HeLa M17 e coltivate sono state raccolte con il metodo descritto nel (cella di raccolta 3.) il protocollo e il tessuto del midollo spinale del mouse è stato ottenuto. Il / tessuto del midollo spinale pellet cellulare è stato posto in un tubo con il tampone di lisi descritto nella sezione di preparazione del reagente. Pellet cellulari sono stati lisati con perle di vetro (Figura 1A) e campioni di tessuto del midollo spinale di topo sono stati omogeneizzati usando l'omogeneizzatore (Figura...

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Discussione

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Dal momento che l'ubiquitinazione è un attività cellulare fondamentale, la comprensione dei meccanismi di regolamentazione potrebbe essere la chiave per dissotterrare i processi di malattia e patologia. L'uso di HA tagged sito diretto sonde attive Ub-derivati ​​qui riportati fornisce un metodo semplice, ma altamente applicabile per studiare la degradazione delle proteine ​​Ub-mediata. Questo metodo è più rapido e meno costoso di studiare ciascuno dei dubs singolarmente.

In questo met...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare il laboratorio Lee dell'Università del Minnesota per fornire i campioni di tessuto del midollo spinale del mouse che sono stati utilizzati. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, con la Ricerca sul Cancro e Fondo comunitario Randy Shaver a MB e dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) a MB. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PowerGen 125 (omogeneizzatore)Fischer Scientific14-261-02P
Filtri a vuoto 0,22 &; micro; mBPV2210
Perle di vetro, lavate con acido ≤ 106 µ m (~140 setaccio USA)Sigma-aldrichG4649-10G
SaccarosioFischer ScientificS6-212
DL-ditiotreitoloSigma-AldrichD0632
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266
Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idratoSigma-AldrichA26209
Trizma cloridratoSigma-AldrichT3253
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010-023
Pallone per coltura tissutale 75 cm2 con tazza filtrante 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Anticorpo monoclonale anti-HA prodotto nel topoSigma-AldrichH9658
Ubiquitina vinilsulfone (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, riducente)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein kit di testThermo Scientific23225

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

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