Method Article

Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

DOI:

10.3791/52784

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May 10th, 2015

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In This Article

Summary

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Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.

Abstract

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Il sistema ubiquitina-proteasoma è stato recentemente coinvolto in diverse patologie, tra cui le malattie neurodegenerative e il cancro. Alla luce di questo, tecniche per studiare il meccanismo di regolazione di questo sistema sono essenziali per chiarire i processi cellulari e molecolari delle malattie summenzionate. L'uso di emoagglutinina derivante sonde ubiquitina delineate nel presente documento è uno strumento prezioso per lo studio di questo sistema. Dettagli Questo documento un metodo che consente all'utente di eseguire saggi che danno una visualizzazione diretta della deubiquitinating attività enzimatica. Enzimi Deubiquitinating controllano la degradazione del proteasoma e condividono un'omologia funzionale ai loro siti attivi, che permette all'utente di indagare l'attività di diversi enzimi in un test. Lisati sono ottenuti attraverso dolce rottura delle cellule meccanico e incubate con sito attivo sonde dirette. Enzimi funzionali sono contrassegnati con le sonde mentre enzimi inattivi rimangono non legato. Di corsaning questo test, l'utente ottiene informazioni sia l'attività e potenziale espressione di molteplici enzimi deubiquitinating in modo facile e veloce. Il metodo attuale è molto più efficiente rispetto all'utilizzo anticorpi individuali per i predetti cento enzimi deubiquitinating nella cellula umana.

Introduction

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Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) serve come una delle principali vie di degradazione in cellule di mammifero. Substrati legati per la degradazione nel proteasoma sono covalentemente contrassegnati con polimeri di ubiquitina (Ub) 1. Prima che il substrato bersaglio entra proteasoma per la degradazione, l'etichetta poli-ubiquitina deve essere rimosso. Una classe di enzimi noti come deubiquitinating enzimi (dubs) è responsabile per la rimozione e il riciclaggio delle molecole di ubiquitina 2. E 'stato previsto dal genoma umano che ci sono quasi un centinaio dubs che lavorano nella cella 3. Con un gran numero di dubs che con....

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Protocol

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1. Lysis Buffer Preparazione

  1. Sciogliere il saccarosio in acqua deionizzata (DI) acqua per fare una soluzione stock 2 M. Filtrare una soluzione 2 M di saccarosio con un aspirapolvere azionato 0,22 micron fluoruro di polivinilidene (PVDF) filtro.
  2. Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 500 mm e conservare in condizioni anaerobiche. Sciogliere il cloruro di magnesio (MgCl 2) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 100 mm. Sciogliere adenosina trifosfato (ATP) disodio idrato in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 50 mm.
  3. Portare una soluzione Tris a pH 7,4 scio....

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Results

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Cellule HeLa M17 e coltivate sono state raccolte con il metodo descritto nel (cella di raccolta 3.) il protocollo e il tessuto del midollo spinale del mouse è stato ottenuto. Il / tessuto del midollo spinale pellet cellulare è stato posto in un tubo con il tampone di lisi descritto nella sezione di preparazione del reagente. Pellet cellulari sono stati lisati con perle di vetro (Figura 1A) e campioni di tessuto del midollo spinale di topo sono stati omogeneizzati usando l'omogeneizzatore (Figura.......

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Discussion

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Dal momento che l'ubiquitinazione è un attività cellulare fondamentale, la comprensione dei meccanismi di regolamentazione potrebbe essere la chiave per dissotterrare i processi di malattia e patologia. L'uso di HA tagged sito diretto sonde attive Ub-derivati ​​qui riportati fornisce un metodo semplice, ma altamente applicabile per studiare la degradazione delle proteine ​​Ub-mediata. Questo metodo è più rapido e meno costoso di studiare ciascuno dei dubs singolarmente.

In questo met.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare il laboratorio Lee dell'Università del Minnesota per fornire i campioni di tessuto del midollo spinale del mouse che sono stati utilizzati. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, con la Ricerca sul Cancro e Fondo comunitario Randy Shaver a MB e dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) a MB. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PowerGen 125 (omogeneizzatore)Fischer Scientific14-261-02P
Filtri a vuoto 0,22 &; micro; mBPV2210
Perle di vetro, lavate con acido ≤ 106 µ m (~140 setaccio USA)Sigma-aldrichG4649-10G
SaccarosioFischer ScientificS6-212
DL-ditiotreitoloSigma-AldrichD0632
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266
Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idratoSigma-AldrichA26209
Trizma cloridratoSigma-AldrichT3253
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Soluzione salina tamponata con fosfatoLife Technologies10010-023
Pallone per coltura tissutale 75 cm2 con tazza filtrante 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Anticorpo monoclonale anti-HA prodotto nel topoSigma-AldrichH9658
Ubiquitina vinilsulfone (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, riducente)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein kit di testThermo Scientific23225

References

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  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D.

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Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

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