Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

Sommario

Qui, descriviamo un approccio di microscopia ottica semi-invasiva per l'induzione di un coagulo fototrombotico di Rose Bengal nella corteccia somatosensoriale di un topo in vivo. Vengono descritti gli aspetti tecnici della procedura di imaging, dall'induzione di un evento fototrombotico all'applicazione e alla raccolta dei dati.

Abstract

Le tecniche di imaging in vivo sono aumentate nell'utilizzo a causa dei recenti progressi nei coloranti di imaging e nelle tecnologie ottiche, consentendo la capacità di visualizzare eventi cellulari in un animale intatto. Inoltre, la capacità di indurre stati patologici fisiologici come l'ictus in vivo ne aumenta l'utilità. La tecnica qui descritta consente la valutazione fisiologica delle risposte cellulari all'interno del SNC a seguito di un ictus e può essere adattata ad altre condizioni patologiche in fase di studio. La tecnica presentata utilizza l'eccitazione laser del colorante fotosensibile Rose Bengal in vivo per indurre un evento ischemico focale in un singolo vaso sanguigno.

Il protocollo video dimostra la preparazione di una finestra cranica sottile sopra la corteccia somatosensoriale in un topo per l'induzione di un evento fototrombotico di Rose Bengal, mantenendo al minimo il danno alla dura materia sottostante e al cervello. La preparazione chirurgica viene inizialmente eseguita sotto un microscopio da dissezione con una piattaforma chirurgica/di imaging su misura, che viene poi trasferita a un microscopio confocale dotato di un adattatore per obiettivo invertito. Vengono presentate immagini rappresentative acquisite utilizzando questo protocollo e sequenze time-lapse dell'induzione dell'ictus. Questa tecnica è potente in quanto la stessa area può essere visualizzata ripetutamente nei giorni successivi, facilitando gli studi longitudinali in vivo dei processi patologici successivi all'ictus.

Introduzione

La tecnica descritta consente la visualizzazione delle risposte cellulari in vivo subito dopo l'induzione di Rosa Bengala photothrombosis in un mouse intatto. Rosa Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) è un colorante fotosensibile usato per indurre ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto). A seguito di una iniezione in bolo di RB attraverso la vena della coda e la successiva illuminazione attraverso un cranio diluito con una luce laser 564 nm, un trombo è indotta causando un ictus fisiologica ^1. Il metodo è stato originariamente descritto da Rosenblum e El-Sabban nel 1977, ed è stato successivamente adattato da Watson a metà 1980 ^1,2. In breve, Rosa Bengala viene irradiata con luce verde di eccitazione (laser 561 nm nel nostro caso), che genera la produzione di specie reattive dell'ossigeno, che attiva successivamente fattore tissutale, un iniziatore della cascata coagulativa. L'induzione della cascata coagulativa produce un ischemico lesione che è patologicamente rilevanti per ictus clinica ^3.

Corsa ha una fisiopatologia complessa a causa della interazione di molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni, glia, endotelio e il sistema immunitario. Scegliere la tecnica migliore per studiare un particolare processo cellulare richiede più considerazioni. Tecniche sperimentali rientrano ampiamente in una delle tre categorie: in vitro, in vivo e in silico con ciascuno che ha vantaggi e svantaggi Gli studi in vitro hanno lo svantaggio principale di rimuovere le cellule dal loro ambiente naturale e quindi non possono riprodurre effetti osservati in un intatto,. animale vivente. Nelle tecniche vivo fornire per la replica sperimentale maggiore di patologie con maggiore rilevanza traslazionale. In silico si riferisce generalmente alla modellazione al computer di una malattia o di processo cellulare, e mentre sempre più utilizzato per studiare potenziali interazioni farmacologiche per esamepio, tutte le informazioni raccolte devono ancora essere testato in cellule o tessuti viventi.

Il modello ideale di ictus in ambiente di laboratorio deve dimostrare le caratteristiche patologiche simili a quelli osservati nella popolazione umana. Mentre ci sono caratteristiche fisiologiche comuni di ictus nella popolazione umana, ci sono anche molte differenze a seconda del tipo di lesione sperimentato. Corsa nella popolazione umana si verifica come piccoli o grandi occlusioni dei vasi, lesioni emorragiche, e l'arteria a un'arteria o cardio-embolie che si traducono in vari volumi infarto così come le differenze nei meccanismi relativi a ciascuna patologia. Il vantaggio di utilizzare modelli animali di ictus è la generazione di infarti riproducibili che imitano le caratteristiche di ictus umana. I modelli corsa più comuni animali includono occlusione utilizzando: mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (metodi incandescenza embolici o endovascolare), che i modelli distale MCAO e il modello photothrombosis. I vantaggi di und svantaggi di ciascun modello sono stati riesaminati altrove (vedi ⁴ e ^5). Modelli globali ischemici (MCAO), mentre relativamente facile da eseguire sono meno rilevanti per ictus umano che sono modelli ictus focali. Inoltre, questi metodi sono molto variabili nell'indurre riproducibili lesioni infarto cerebrale. Il modello photothrombosis è altamente riproducibile finché sperimentatore controlla loro esperimenti bene, fornendo un chiaro vantaggio rispetto ai modelli MCAO. Tuttavia, a causa microcircolo insultare il modello è stato descritto per visualizzare una penombra ischemica minima, l'area in cui le cellule si pensa siano recuperabili ^6,7. Inoltre, vasogenico e formazione edema citotossico possono essere indotte dopo irradiazione dell'area imaging. Nonostante queste limitazioni la tecnica ha fornito una nuova visione molti processi fisiologici seguenti ictus ^{8, 9, 10, 11.}

Protocollo

Nota: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Texas Health Science Center di San Antonio e sono stati coerenti con le linee guida arrivano.

1. anestetizzante per corticale Preparazione

1. Posizionare il mouse in una camera di induzione con 2-3% isofluorano mescolato con l'ossigeno per indurre anestesia. Osservare il calo tasso di respirazione come il mouse è indotta. Stringere la zampa del mouse per determinare se il mouse è pronto per passare al cono. Nota: il livello di anestesia è un passo fondamentale in qualsiasi preparazione in vivo e si deve prestare attenzione a non indurre un livello tale da provocare ischemia globale.
2. Una volta che il mouse sia sufficientemente anestetizzato, trasferire l'animale alla chirurgia piattaforma / imaging e mettere il naso del mouse nella cono e applicare 1-1,2% isofluorane a mantenere uno stato anestetizzato. Assicurarsi che il mouse è sdraiata su una temperatura di coriscaldamento pad ntrolled per mantenere la temperatura corporea (37 ° C +/- 0.5 ° C) durante le procedure rimanenti. Posizionare veterinario pomata sopra gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Monitorare la fisiologia del mouse utilizzando un sistema pulsossimetria utilizzando la clip coda o piede fornito con il sistema. Controllare che la frequenza respiratoria è mantenuta tra 50-65 atti / min. Verificare che la frequenza cardiaca rimane tra 300 e 450 bpm e la saturazione di ossigeno viene mantenuta tra 97-98% per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell'animale.
4. Quando il mouse è adeguatamente anestetizzato, radersi i capelli sul cranio con cesoie elettriche, rimuovere i capelli residui e pulita con betadine, seguito da un tampone di etanolo. Ripetere questa procedura fino a tre volte per garantire un ambiente sterile chirurgico.

2. Procedura chirurgica

1. Con il cuoio capelluto completamente pulito e rasato, fare una incisione di 5 mm del cuoio capelluto del mouse per rivelare il fissu cranicores e per individuare bregma.
2. Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio.
3. Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all'osso sovrastante corteccia parietale utilizzando le coordinate stereotassica di Bregma: -1 a -3 mm e laterale: 2-4 mm. Nota: La colla definisce tipicamente entro 2 minuti dopo il posizionamento dell'anello sull'osso.
4. Fissare l'anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l'imaging.
5. Sotto un microscopio da dissezione chirurgica grado, lentamente praticare un tratto di 1-2 mm nel cranio con un Dremel simile velocità controllata (Meisinger 3,9 millimetri punta) facendo attenzione a mantenere il livello di zona, è forato. Raggiungere questo obiettivo con un percorso a zig-zag. Per evitare l'accumulo di calore, impostare la velocità di punta al minimo e fate pause frequenti.
6. Quando il teschio cranica diventa shinny in apparenza, continua il diradamentodel cranio con una lama di bisturi utilizzando lo stesso andamento a zig-zag per mantenere il livello della superficie assottigliata per facilitare la rimozione regolare di strati sottili del cranio cranica. Utilizzando la punta della lama di bisturi fare piccoli tratti lineari con una leggera pressione per rimuovere gli strati sottili di osso per volta. Continuare questo fino a quando il sistema vascolare è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione.
7. Se lo sperimentatore perfora attraverso o rompere il cranio durante il processo di assottigliamento, l'eutanasia degli animali a causa di probabili danni alla corteccia sottostante.
   Nota: Il cranio mouse è di circa 300 micron di spessore ed è composto da due strati sottili di osso compatto (uno esterno e uno strato interno) e uno strato di osso spugnoso a sandwich tra i due strati di osso compatto. Lo strato esterno dell'osso compatto e più dell'osso spugnoso vengono rimossi nella zona di foratura 5 millimetri conseguente approssimativa strato 50 micron dell'osso compatto rimanente (vedere la Figura 2B). Visualizzione del sistema vascolare farà in modo che la finale intatto cranio diluito è di circa 50 micron di spessore. Il cranio è quindi ancora presente quando assottigliato a questo spessore.

3. Microscopio Set-up

1. Utilizzare un sistema di microscopio invertito (convenzionale, confocale o sistemi a due fotoni) che ha un inverter obiettivo. Nota: È anche possibile utilizzare un microscopio verticale standard. Il fattore limitante sarà lo spazio tra la fase e gli obiettivi. Le modifiche al palco può essere necessario per realizzare questa configurazione.
2. Fissare la piattaforma chirurgica / imaging per una fase su misura che si trova oltre la base del microscopio. Nota: La piattaforma è realizzata con un martinetto di laboratorio per consentire il movimento verticale della piattaforma chirurgica / immagini oggetto dell'obiettivo. La presa di laboratorio è montato su una targhetta fissata a quattro pali cilindrici. (Vedi figura 2).
3. Posizionare l'inverter obiettivo contenente un 20Xobiettivo nel finestra del cranio. Utilizzare una fonte di luce esterna per trovare la finestra del cranio, cercando attraverso gli oculari del microscopio e posizionare l'obiettivo nell'area imaging. Nota: L'area di esposizione verrà indicata dalla presenza del sistema vascolare.
4. Per obiettivi a base d'acqua, usare fluido cerebrale spinale artificiale (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl, 12 mM KH ₂ PO _4; 200 mM NaHCO _3; HEPES 30 mM e 100 mM di glucosio) come mezzo a causa della potenziale perdite nella cavità cranica durante l'imaging (Figura 3).

4. Rosa Bengala Dye Preparazione, gestione e induzione di corsa

1. Preparare una soluzione / ml fresco 20 mg di Rosa Bengala in artificiale cerebrali liquido spinale (aCSF); filtrare e sterilizzare prima della somministrazione. Non riutilizzare o conservare la Rose del Bengala, una volta che è stato mescolato. Fare una soluzione fresca per ogni esperimento.
2. Dare un iniezione vena 0,1 ml coda della Rosa Bengala mentre sinscatolare finestra cranica con un laser 561 nm a garantire un'adeguata iniezione della soluzione. Nota: Rosa Bengala verrà visualizzato entro 5 secondi dopo l'iniezione nella vascolatura del cervello. L'intero vaso deve essere riempito con Rosa Bengala.
3. Dopo l'iniezione adeguato di Rosa Bengala colorante scegliere una nave appositamente per la trombosi base di diametro del vaso (40-80 micron) per garantire la riproducibilità di un determinato volume della lesione. Distinguere tra arterie e vene guardando la direzione del flusso sanguigno: arterie si muoveranno da diametro maggiore di vasi di diametro minore, vene spostano da piccolo a vasi di diametro maggiore. Questo è facilmente realizzabile da visualizzazione una volta Rosa Bengala viene iniettato.
4. Modificare l'impostazione del microscopio come segue:
   1. Aumentare il tempo di sosta. Nota: Questo può variare a seconda del sistema di microscopio essendo utilizzato.
   2. Aumentare la potenza del laser al 100%.
   3. Raccogliere le immagini di sequenza temporale a 1 frame / sec con ilvelocità di scansione massima.
5. Acquisire il mouse fino un coagulo stabile si forma all'interno del vaso. Nota: Questo si ottiene in genere entro 5 minuti di scansione continua (vedi figura 4).
6. Dopo l'induzione di formazione di coaguli con Rose del Bengala, togliere il mouse dalla area di esposizione di nuovo al microscopio da dissezione. Rimuovere con attenzione l'anello in acciaio inox dal cranio cranico. Esaminare la finestra del cranio per qualsiasi sanguinamento. In caso di emorragia, interrompere l'esperimento.
7. Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere l'incisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l'infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore.
8. Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento.
9. Ritorna il mouse in una gabbia pulita per ulteriori indagini in un secondo momento.

5. Imaging longitudinale nei giorni successivi

1. Impiegare i seguenti metodi per eseguire l'imaging longitudinale nei giorni successivi dopo photothrombosis.
   1. Anestetizzare il mouse come descritto al punto 1 dei metodi.
   2. Dopo un'adeguata anestesia riaprire il cuoio capelluto, eliminando eventuali suture residui di riaprire la pelle sovrastante il campo dell'imaging precedentemente realizzato.
   3. Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio.
   4. Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all'osso sovrastante campo dell'imaging precedente.
   5. Fissare l'anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l'imaging.
   6. Individuare il sistema vascolare alla base del cranio, in precedenza assottigliata. Utilizzare iniezione vena caudale di FITC-destrano per verificare la presenza del coagulo precedentemente determinati.
   7. Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere la acisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l'infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore.
   8. Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento.

6. Verifica della fase di aspirazione (post-mortem)

1. A conclusione di uno studio, verificare stroke volume usando 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione come mostrato in Figura 5. Il metodo completo può essere trovato in ^12.

Risultati

Lo scopo di questo metodo è di indurre un ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto) a seguito di un bolo di RB attraverso la vena della coda e successiva illuminazione di un cranio diluito con una luce laser 561 nm. Le immagini in Figura 4 mostrano la progressione della formazione del coagulo in un unico recipiente dopo irradiazione dell'area a 0, 1, 1,5 e 2 min. Prima di formazione di coaguli l'intero vaso è bianco a causa di flusso libero Rosa Bengala. Dopo l'induzione di irradiazi...

Discussione

La capacità di tradurre sperimentale corsa fisiopatologia da animale ad applicazione umana è stata colpita con il fallimento. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali, come il modello photothrombosis, permette una migliore comprensione di ictus fisiopatologia e l'esplorazione di nuovi approcci terapeutici per fornire neuroprotezione a seguito di un ictus. Piccoli colpi corticali e microinfarctions prodotte dal modello photothrombotic sono clinicamente rilevanti per subcliniche o "silenzioso" colpo ^...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurano Anestetico	MWI Fornitura Veterinaria	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 2 mM di MgCl2, 2 mM di CaCl2, 10 mM di glucosio e 26 mM di NaHCO3 (pH 7,4).
[header]
Forbici
da dissezione	bioindustriali	500-410
Forbici operative 14 cm	Prodotti bioindustriali	12-055
Pinze Dumont High Tech #5 style, prodotti	bioindustriali	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Piattaforma per Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Supporto per barra auricolare da configurazione stereotassica	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Macchina per anestesia per roditori	DRE, Inc.	15001
Tech IV Vaporizzatore di isoflurano	DRE, Inc.	34001
F Bomboletta d'aria	DRE, Inc	80120
Tubo di respirazione del circuito del bain	DRE, Inc	86111B
Adattatore per roditori per tubo del bain	DRE, Inc	891000
Regolatore O2 per serbatoi di ossigeno	DRE, Inc	CE001E
Camera di induzione per roditori	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 pollici con ago P-3	Suture Express	1639G
Obiettivo inverter Adattatore ottico Tecnologie	LSM Trapano
a doppio voltaggio 110/120	Foro	134,53
Meisinger Punta da trapano da 3,9 mm	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)

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