Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
La tecnica descritta consente la visualizzazione delle risposte cellulari in vivo subito dopo l'induzione di Rosa Bengala photothrombosis in un mouse intatto. Rosa Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) è un colorante fotosensibile usato per indurre ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto). A seguito di una iniezione in bolo di RB attraverso la vena della coda e la successiva illuminazione attraverso un cranio diluito con una luce laser 564 nm, un trombo è indotta causando un ictus fisiologica 1. Il metodo è stato originariamente descritto da Rosenblum e El-Sabban nel 1977, ed è stato successivamente adattato da Watson a metà 1980 1,2. In breve, Rosa Bengala viene irradiata con luce verde di eccitazione (laser 561 nm nel nostro caso), che genera la produzione di specie reattive dell'ossigeno, che attiva successivamente fattore tissutale, un iniziatore della cascata coagulativa. L'induzione della cascata coagulativa produce un ischemico lesione che è patologicamente rilevanti per ictus clinica 3.
Corsa ha una fisiopatologia complessa a causa della interazione di molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni, glia, endotelio e il sistema immunitario. Scegliere la tecnica migliore per studiare un particolare processo cellulare richiede più considerazioni. Tecniche sperimentali rientrano ampiamente in una delle tre categorie: in vitro, in vivo e in silico con ciascuno che ha vantaggi e svantaggi Gli studi in vitro hanno lo svantaggio principale di rimuovere le cellule dal loro ambiente naturale e quindi non possono riprodurre effetti osservati in un intatto,. animale vivente. Nelle tecniche vivo fornire per la replica sperimentale maggiore di patologie con maggiore rilevanza traslazionale. In silico si riferisce generalmente alla modellazione al computer di una malattia o di processo cellulare, e mentre sempre più utilizzato per studiare potenziali interazioni farmacologiche per esamepio, tutte le informazioni raccolte devono ancora essere testato in cellule o tessuti viventi.
Il modello ideale di ictus in ambiente di laboratorio deve dimostrare le caratteristiche patologiche simili a quelli osservati nella popolazione umana. Mentre ci sono caratteristiche fisiologiche comuni di ictus nella popolazione umana, ci sono anche molte differenze a seconda del tipo di lesione sperimentato. Corsa nella popolazione umana si verifica come piccoli o grandi occlusioni dei vasi, lesioni emorragiche, e l'arteria a un'arteria o cardio-embolie che si traducono in vari volumi infarto così come le differenze nei meccanismi relativi a ciascuna patologia. Il vantaggio di utilizzare modelli animali di ictus è la generazione di infarti riproducibili che imitano le caratteristiche di ictus umana. I modelli corsa più comuni animali includono occlusione utilizzando: mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (metodi incandescenza embolici o endovascolare), che i modelli distale MCAO e il modello photothrombosis. I vantaggi di und svantaggi di ciascun modello sono stati riesaminati altrove (vedi 4 e 5). Modelli globali ischemici (MCAO), mentre relativamente facile da eseguire sono meno rilevanti per ictus umano che sono modelli ictus focali. Inoltre, questi metodi sono molto variabili nell'indurre riproducibili lesioni infarto cerebrale. Il modello photothrombosis è altamente riproducibile finché sperimentatore controlla loro esperimenti bene, fornendo un chiaro vantaggio rispetto ai modelli MCAO. Tuttavia, a causa microcircolo insultare il modello è stato descritto per visualizzare una penombra ischemica minima, l'area in cui le cellule si pensa siano recuperabili 6,7. Inoltre, vasogenico e formazione edema citotossico possono essere indotte dopo irradiazione dell'area imaging. Nonostante queste limitazioni la tecnica ha fornito una nuova visione molti processi fisiologici seguenti ictus 8, 9, 10, 11.
La capacità di tradurre sperimentale corsa fisiopatologia da animale ad applicazione umana è stata colpita con il fallimento. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali, come il modello photothrombosis, permette una migliore comprensione di ictus fisiopatologia e l'esplorazione di nuovi approcci terapeutici per fornire neuroprotezione a seguito di un ictus. Piccoli colpi corticali e microinfarctions prodotte dal modello photothrombotic sono clinicamente rilevanti per subcliniche o "silenzioso" colpo <su…
The authors have nothing to disclose.
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Reagents | |||
Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
[header] | |||
Equipment | |||
Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |