Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Sandra Meyer; Philipp Wörsdörfer; Katharina Günther; Marc Thier; Frank Edenhofer

doi:10.3791/52831

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Articolo metodologico

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

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DOI:

10.3791/52831

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29 luglio 2015

Sandra Meyer¹^,² , Philipp Wörsdörfer¹ , Katharina Günther¹ , Marc Thier²^,³ , Frank Edenhofer¹^,²

¹Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Würzburg, ²Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, ³German Cancer Research Center, Heidelberg

In questo articolo

Sommario

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Abstract

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l'isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l'integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l'espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.

Introduzione

Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente ^1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l'equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell'organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani ^2. Gli esperi....