Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

Summary

Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo per consentire il tracciamento delle cellule attraverso il ciclo cellulare senza richiedere la sincronizzazione delle cellule. Ottenere la sincronizzazione cellulare può essere difficile per molti sistemi cellulari. La pratica standard consiste nel bloccare la progressione del ciclo cellulare in una fase specifica e quindi rilasciare le cellule accumulate producendo un'onda di cellule che progrediscono attraverso il ciclo all'unisono. Tuttavia, alcuni tipi di cellule trovano questo blocco tossico con conseguente ciclo cellulare anormale o addirittura morte di massa. L'assorbimento della bromodeossiuridina (BrdU) può essere utilizzato per monitorare la fase del ciclo cellulare delle singole cellule. Le cellule incorporano questo analogo sintetico della timidina, mentre sintetizzano nuovo DNA durante la fase S. Fornendo BrdU per un breve periodo è possibile marcare un pool di cellule che erano in fase S mentre la BrdU era presente. Queste cellule possono quindi essere tracciate attraverso il resto del ciclo cellulare e nel successivo ciclo di replicazione, consentendo di determinare la durata delle fasi del ciclo cellulare senza la necessità di indurre un blocco del ciclo cellulare potenzialmente tossico. È anche possibile determinare e correlare l'espressione di proteine interne ed esterne durante le fasi successive del ciclo cellulare. Questi possono essere utilizzati per perfezionare ulteriormente l'assegnazione della fase del ciclo cellulare o valutare gli effetti su altre funzioni cellulari come l'attivazione del checkpoint o la morte cellulare.

Introduction

La valutazione delle caratteristiche del ciclo cellulare e cambiamenti che si verificano nelle cellule durante la progressione del ciclo cellulare è fondamentale per capire molti aspetti della biologia, in particolare biologia del cancro. Molti agenti di sviluppo per il trattamento di tumori maligni hanno effetti profondi sulla progressione del ciclo cellulare o indurre la morte cellulare per ciclo cellulare dipendente-meccanismi. Per studiare la dinamica del ciclo cellulare o cellule in una particolare fase del ciclo cellulare, si è soliti sincronizzare cellule. Tuttavia metodi di sincronizzazione possono avere effetti negativi sulle cellule in fase di studio, poten....

Protocol

Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare linfoblastica acuta leucemia NALM6 ma può essere applicato ad altri tipi di cellule.

1. Soluzioni e reagenti

1. Completa RPMI
   1. Aggiungere 56 ml di siero fetale bovino (FCS) e 5,5 ml di 200 mM di L-glutammina in un flacone da 500 ml di mezzo RPMI-1640.
2. BrdU Stock Solution
   1. Preparare 32.5 BrdU mm (10 mg / ml) in Dulbecco tampone fosfato (DPBS).
3. BrdU completo RPMI
   1. Aggiungere 6,2 ml di soluzione madre BrdU per 10 ml di RPMI completo.
4. DNase Soluzione
   1. Preparare 1 mg DNase / ml in DPBS.

Results

Questo metodo può essere utilizzato per ottenere una serie di informazioni. Alcune applicazioni sono elencate qui.

Valutazione della durata del ciclo cellulare

Per determinare il tempo necessario per le cellule di transito attraverso il ciclo cellulare, le cellule vengono raccolte in vari momenti seguenti dell'impulso BrdU. Gli intervalli tra le valutazioni possono essere adattati alle particolari cellule essere analizzati. Linee cellulari ematopoietiche sono sta.......

Discussion

La capacità di analizzare il ciclo cellulare è importante per la comprensione della biologia del cancro e il meccanismo di azione di entrambi i farmaci e geni che influenzano la proliferazione e la crescita cellulare. Mentre ci sono una moltitudine di saggi che misurano riferito proliferazione cellulare, la maggioranza solo fornire una misura che indica le cellule numerici presenti. Questi includono test che misurano il numero di cellulare per la visualizzazione diretta e il conteggio, l'attività metabolica o la con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di flusso APC BrdU	BD Biosciences	552598	contiene anticorpo BrdU, tampone 7-AAD e BD Cytofix/Cytoperm (indicato come tampone di fissazione)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	indicato come tampone di permeabilizzazione
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	indicato come tampone di lavaggio
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  mm FACS tubi	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA citometro	a flusso BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1.640 senza L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Siero fetale bovino	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutammina	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deossiuridina	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 Flaconi ventilati	BD Biosciences	355001
Pipette 25  ml	Greiner	760180
Pipette Aersol 200  µ l	Interpath	24700
Pipette Aersol 1  ml	Interpath	24800
Centrifuga	Spintron	GT-175R
CO2 incubatore	Binder	C 150
AF488 anti-istonico H3 Fosfo (Ser10) Anticorpo	di segnalazione cellulare	9708S
Fosfo-Chk2 (Thr68) (C13C1) Coniglio mAb	Segnalazione cellulare	2197S
Fosfo-Chk1 (Ser345) ( 133D3)	Segnalazione cellulare	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128