Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da Escherichia coli Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Sommario

Le tecnologie ricombinanti hanno permesso ai progettisti di materiali di creare nuove proteine artificiali con funzionalità personalizzate per applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, le proteine artificiali della matrice extracellulare possono essere progettate per incorporare domini strutturali e biologici derivati da ECM native. Qui, descriviamo la costruzione e la purificazione di proteine aECM contenenti ripetizioni simili all'elastina.

Abstract

La tecnologia ricombinante è una piattaforma versatile per creare nuove proteine artificiali con proprietà regolabili. Nell'ultimo decennio, sono state riportate molte proteine artificiali che hanno incorporato domini funzionali derivati dalla natura (o creati de novo). In particolare, sono state sviluppate proteine della matrice extracellulare artificiale (aECM); queste proteine aECM sono costituite da domini biologici prelevati da fibronectina, laminine e collageni e sono combinate con domini strutturali tra cui ripetizioni simili all'elastina, ripetizioni di seta e collagene. Ad oggi, le proteine aECM sono state ampiamente studiate per applicazioni nell'ingegneria tissutale e nella riparazione delle ferite. Recentemente, Tjin e collaboratori hanno sviluppato proteine aECM integrina-specifiche progettate per promuovere l'attaccamento e la propagazione dei cheratinociti della pelle umana. Nel loro lavoro, le proteine aECM incorporano domini di legame cellulare prelevati da fibronectina, laminina-5 e collagene IV, oltre a ripetizioni simili all'elastina. Hanno dimostrato che le proteine aECM sviluppate nel loro lavoro erano candidati promettenti per l'uso come substrati nella pelle artificiale. Qui, descriviamo la progettazione e la costruzione di tali proteine aECM, nonché il loro processo di purificazione utilizzando le caratteristiche termo-reattive dell'elastina.

Introduzione

Per diversi decenni, sia i materiali sintetici che quelli naturali sono stati esplorati per l'uso come scaffold nell'ingegneria dei tessuti^1,2. Sebbene i materiali sintetici come i polimeri offrano un'eccellente integrità strutturale e proprietà meccaniche regolabili, spesso hanno una bioattività insufficiente per promuovere la crescita e l'infiltrazione dei tessuti. D'altra parte, i materiali naturali come le proteine della matrice extracellulare (ECM) hanno un'eccellente attività biologica, ma presentano limitazioni come la variabilità da lotto a lotto, la rapida degradazione e i problemi di immunogenicità. Pertanto, le proteine ricombinanti sono desiderabili, poiché possono essere progettate per imitare solo le proprietà desiderabili delle proteine native^3,4.

L'ingegneria delle proteine ricombinanti ha raccolto un ampio interesse come piattaforma versatile per la progettazione e la produzione di nuovi biopolimeri proteici artificiali. Controllando la sequenza genetica, le funzionalità delle proteine artificiali possono essere adattate per un'ampia varietà di applicazioni^5,6. In particolare, le proteine della matrice extracellulare artificiale (aECM) possono essere adattate per avere molteplici funzionalità per applicazioni nell'ingegneria tissutale, nella rigenerazione e nella riparazione delle ferite^2,7. Ancora più importante, i progressi nelle tecnologie di clonazione e purificazione hanno aumentato la scalabilità e ridotto enormemente i costi di produzione delle proteine ricombinanti. È possibile produrre grandi quantità di proteine ricombinanti a bassi costi di produzione che sono economici per l'uso in clinica⁵.

Le proteine artificiali della matrice extracellulare sono state sviluppate per applicazioni di ingegneria tissutale^8-11. Ad esempio, Tirrell et al. hanno progettato un innesto vascolare di piccolo diametro utilizzando proteine artificiali contenenti la sequenza di fibronectina CS5 e ripetizioni simili all'elastina (ELP-CS5). Hanno dimostrato che le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) erano in grado di aderire e crescere su questi materiali¹². Altri hanno anche incorporato brevi sequenze bioattive prelevate da fibronectina, collagene, laminina, fibrinogeno e vitronectina, nonché domini strutturali che imitano l'elastina, la seta di ragno e i collageni per creare una varietà di proteine di fusione¹⁰. Anche i film reticolati di massa costituiti da proteine aECM a base di elastina hanno mostrato proprietà meccaniche simili a quelle dell'elastina nativa (i moduli elastici variano tra 0,3 e 0,6 MPa)¹³. Successivamente, è stato riportato che le proteine aECM contenenti frammenti di fibronectina più lunghi accelerano la guarigione delle ferite in vitro a causa dell'aumento delle affinità di legame delle integrine⁸.

Recentemente, le proteine ECM artificiali specifiche per le integrine sono state sviluppate da Tjin e collaboratori¹⁴. Ogni proteina aECM contiene un dominio bioattivo di legame cellulare prelevato dai componenti ECM della pelle umana nativa^2,7,15, come la laminina-5, il collagene-IV e la fibronectina. Ad esempio, è stato dimostrato che l'integrina α₃Β₁ lega la sequenza PPFLMLLKGSTR trovata nel dominio globulare 3 (LG3)16,17 della catena della laminina-5 alfa-3 (LG3)^16,17. Nel loro rapporto, hanno dimostrato che i cheratinociti epidermici della pelle umana primaria impegnano preferenzialmente diverse integrine per legarsi a ciascuna delle proteine aECM, a seconda del tipo di dominio di legame cellulare presente.

Le proteine aECM discusse nel lavoro di Tjin et al. contengono domini simili all'elastina {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈ che conferiscono elasticità che imita le proprietà meccaniche della pelle umana. Inoltre, l'incorporazione di residui di lisina all'interno delle ripetizioni simili all'elastina aumenta anche la solubilità proteica complessiva nei solventi acquosi. Inoltre, i residui di lisina fungono anche da siti di reticolazione per facilitare la formazione di film aECM reticolati¹². L'inclusione di ripetizioni simili all'elastina all'interno della sequenza proteica aECM consente di purificare facilmente le proteine tramite il ciclo di transizione inversa (ITC)¹⁴. Le elastine subiscono una transizione di fase brusca e reversibile a una temperatura specifica nota come temperatura critica inferiore della soluzione (LCST) o temperatura di transizione inversa (T_t)^18-20. Le elastine e le ripetizioni simili all'elastina adottano conformazioni di bobine casuali idrofile al di sotto del loro LCST e diventano solubili in acqua, mentre al di sopra del loro LCST, le elastine si aggregano rapidamente in particelle di dimensioni micron. Tali transizioni di fase sono reversibili e quindi possono essere sfruttate per consentire alle proteine aECM a base di elastina di essere facilmente purificate tramite la tecnica ITC²¹.

In questo lavoro, riportiamo una procedura generalizzata per progettare, costruire e purificare proteine ECM artificiali contenenti domini bioattivi di legame cellulare, fusi in ripetizioni simili all'elastina. Viene descritto il processo per progettare e clonare i plasmidi che codificano per le sequenze di amminoacidi per le proteine aECM. Vengono delineati i passaggi necessari per purificare le proteine aECM utilizzando l'ITC. Infine, vengono discussi i metodi per determinare la purezza delle proteine aECM ottenute mediante elettroforesi SDS-PAGE e Western Blotting.

Protocollo

1. Clonazione di ricombinante plasmidi codifica per proteine ​​AECM

1. Progettare la sequenza aminoacidica del dominio funzionale (ad esempio, cellule dominio vincolanti e ripete elastina-like). Siti di restrizione design che fiancheggiano le estremità dei domini funzionali per facilitare sub-clonazione usando il software libero secondo le istruzioni del software (ad esempio, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Qui, selezionare i siti unici di restrizione che non sono presenti nel dominio funzionale di confinare la digestione ai siti previsti. Scegliere siti di restrizione che appaiono nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore host (ad esempio, pET22b (+)) per sub-clonazione.
2. Reverse sequenza di amminoacidi nella sequenza nucleotidica utilizzando siti gratuiti secondo le istruzioni del software. (Ad esempio, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Assicurarsi codoni sono ottimizzati per E. host coli.
3. Gene di interesse può essere purchasoligonucleotidi incagliati ed in commercio come singoli (cioè, se gli oligonucleotidi <100 coppie di basi (bp)) e permette di effettuare la ricottura del DNA (vedi punto 1.4) per ridurre i costi. In caso contrario, per i geni più grandi di 100 bp, potrebbero essere acquistati attraverso società commerciali.
4. Ricottura DNA degli oligonucleotidi
   1. Ricuocere gli oligomeri di DNA per ottenere la sequenza del gene desiderato. Sciogliere oligonucleotidi di DNA in un buffer oligomero DNA (Tris 10 mM: 2-ammino-2- (idrossimetil) propan-1,3-diolo, pH 8,0, filtrato) ad una concentrazione finale di 1 mg / mL.
   2. Aggiungere 4 ml di ogni oligomero di 32 microlitri di tampone di ricottura DNA (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e 100 nM MgCl ₂₎ per ottenere una miscela totale 40 microlitri.
   3. Far bollire un bicchiere di acqua con una piastra e immergere la miscela per 5 minuti, 95 ° C. Togliere il bicchiere e gradualmente raffreddare l'intero set in una scatola di polistirolo O / N. Gli oligomeri sono stati ricotti e sono pronti per la digestione.
5. Aggiungere i corrispondenti enzimi di restrizione per digerire gli oligomeri ricotto (cioè, denominato insert) e vettore ospitante (cioè, pET22b (+)) separatamente. Utilizzare la seguente ricetta (1-2 mg di DNA, 2 microlitri di ciascun enzima di restrizione, 5 ml di 10x tampone di restrizione enzimatica, e acqua fino a una miscela totale 50 microlitri) per 3-4 ore a 37 ° C.
   NOTA: Il pET22b (+) vettore plasmidico è ampicillina resistenti agli antibiotici e contiene un 6x-His tag al C-terminale. Il 6x-His tag presenti in pET22b (+) ci permette di usare il suo-tagged anticorpi per identificare la proteina bersaglio mediante western blotting al punto 7.
6. Aggiungere caricamento 6x colorante per ogni miscela di digestione. Eseguire le miscele di digestione compreso separatamente una scaletta DNA su 1,2% gel di agarosio DNA contenenti una macchia DNA fluorescente agli UV per 1 ora a 100 V. I dettagli del 1,2% DNA gel di agarosio con un illuminatore luce UV.
7. Tagliate il gel per estrarre prodotti di DNA digeriti utilizzando kit di purificazione gel commerciale. Elute utilizzando il volume minimo della colonna per ottenere una concentrazione minima di DNA di 50-100 ng / ml.
8. Combinare il gene di interesse sequenzialmente legando l'inserto di DNA digerito (cioè, ripetizioni elastina o domini di legame cellulari ottenute mediante ricottura DNA) nel vettore plasmidico utilizzando T4 ligasi utilizzando la seguente ricetta: (2 ml di vettore, 1 ml di T4 ligasi, 1,5 ml di T4 tampone legatura, x ml di inserto, da 10,5 x ml di acqua per una miscela totale 15 ml). Incubare la miscela legatura a temperatura ambiente per 2 ore.
   NOTA: concentrazione molare di vettore inserire deve essere variato per ottimizzare l'efficienza legatura. Volume di inserto descritto come x nella ricetta dipende dalla concentrazione di DNA eluito dal punto 1.7.
9. Thaw E. cellule chimicamente competenti coli DH5α (o qualsiasi sforzo di clonazione) su ghiaccio. Piastre 2xYT Warm agar (Tabella 1) contenente ampicillina (25 mg / ml) a 37 ° C.
10. Trasformare le cellule utilizzandoshock termico:
    1. Aliquota 50 ml di cellule competenti in provette micro-centrifuga pulite, pre-refrigerati. Pipettare 5 microlitri (tra 100 pg a 100 ng) della miscela di ligasi nelle cellule pipettando delicatamente su e giù per miscelare. Lasciare la miscela in ghiaccio per 20 min.
    2. Immergere il tubo micro-centrifuga contenente la miscela di cellule in un bagno d'acqua 42 ° per 2 minuti e tornato in ghiaccio per 2 min. Tempo la durata di immersione per minimizzare i danni del calore alle cellule.
    3. Aggiungere 500 pl di supporti SOC (Tabella 1) nel tubo micro-centrifuga e incubare a 37 ° C con agitazione per 1 ora.
    4. Distribuire 50 500 microlitri della miscela di cellule / legatura su una piastra di agar 2xYT che è stato pre-riscaldato a RT, contenente ampicillina (25 mcg / ml) e incubare le piastre capovolta a 37 ° CO / N (12-16 hr) .
11. Il giorno dopo, raccogliere le colonie di DNA dalla piastra di agar con puntali puliti. Far crescere le colonie in 5 ml di 2YT supporti (Tabella1) contenente ampicillina (25 mg / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 ore) con agitazione (225 rpm).
12. Il giorno seguente, utilizzare un kit di isolamento plasmide per estrarre i plasmidi di DNA per ogni colonia raccolti secondo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 50 ml di acqua.
13. Eseguire un test digest con enzimi di restrizione utilizzando la seguente ricetta: (5 microlitri DNA, 0,2 ml di ogni enzima di restrizione, 1 ml 10x tampone di restrizione enzimatica e acqua rabboccare per una miscela totale 10 microlitri), incubare per 2 ore a 37 ° C a schermo per le colonie che probabilmente contengono l'inserto e corsa su 1,2% gel di agarosio DNA come al punto 1.6.
    NOTA: Dopo la digestione, una legatura di successo dovrebbe risultino due bande, una per ogni vettore e l'inserto che corrispondono ai rispettivi peso molecolare (Figura 1).
14. Invia le colonie probabili per il sequenziamento del DNA usando promotore T7 avanti e indietro primer per sequencer commerciali.

2. Trasformazione di ricombinante plasmidi in Bacterial Manifestazione

1. Dal risultato sequenziamento, selezionare una colonia che è stato ligato con successo e utilizzare il DNA plasmidico per trasformazione in E. ospite espressione coli.
2. Thaw E. ceppo espressione coli (BL21 (DE3) pLysS) su ghiaccio. Nel frattempo, piastre di agar caldi contenenti ampicillina (25 mcg / ml) e cloramfenicolo (34 mg / ml) per RT.
   NOTA: Il plasmide pLysS presente nei batteri ceppo BL21 (DE3) pLysS contiene un gene di resistenza cloramfenicolo. Il plasmide pLysS contiene un repressore gene T7, che è costitutivamente espresso per limitare l'espressione della proteina che perde AECM. Cloramfenicolo è necessario selezionare per cellule batteriche contenenti pLysS durante la coltura.
3. Ripetere il punto 1.10 di ottenere trasformato E. coli che sono pronti a esprimere le proteine ​​artificiali. Avvolgere piastre di agar in Parafilm e conservare a testa in giù a 4 6; C per un massimo di un mese.

3. L'espressione batterica di AECM Proteine

1. Vedere la Figura 2, scegliere una colonia dalla piastra di agar trasformata con un puntale e inoculare in 10 ml di sterili Terrific Broth (TB) i media (Tabella 1) che contiene sia ampicillina e antibiotici cloramfenicolo in una provetta. Incubare questa coltura starter a 37 ° CO / N (12-16 ore) con agitazione a 225 rpm.
2. Trasferimento 10 ml di coltura starter in 1 L mezzi TB freschi e sterili integrate con gli stessi antibiotici in un pallone 3 L Erlenmeyer. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione a 225 rpm per 2-3 ore ed osservare la densità ottica della coltura (OD ₆₀₀₎ raggiunto 0,6-0,8 pipettando 1 ml di coltura in una cuvetta vuota per la lettura. Salva 1 ml di coltura prima dell'induzione per SDS-PAGE caratterizzazione.
   1. Per misurare OD ₆₀₀ della coltura cellulare, preparare 1 fiala di mezzi TB in una provettaper una misurazione vuoto. Separatamente, trasferire 1 ml di coltura dal pallone di coltura in una nuova cuvetta vuota. Misurare la densità ottica della coltura utilizzando uno spettrofotometro contro il controllo in bianco in assorbanza a 600 nm.
   2. Salvare il campione (per la successiva analisi SDS-PAGE) trasferendo i 1 ml di campione di coltura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, centrifugare a 12.000 xg per 2 minuti e decantare il surnatante.
3. Indurre la coltura con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e incubare a 37 ° C con agitazione a 225 rpm per altri 4 ore. Salva 1 ml di coltura alla fine dell'induzione a 4 ore per SDS-PAGE caratterizzazione.
4. Raccogliere le cellule trasferendo cultura per bottiglie da centrifuga 1 L e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante, pesare il pellet di cellule e risospendere in TEN tampone (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M di NaCl, pH = 8.0) a 0,5 g / ml.

4. Lisi di colture batteriche

1. Congelare la coltura cellulare risospeso a -80 ° CO / N. Scongelare la coltura cellulare congelato in un bagno d'acqua a temperatura ambiente o su ghiaccio per lisare le cellule. Aggiungere 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNasi I), 10 mg / ml ribonucleasi A (RNasi I), e 50 ug / ml phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) mentre scongelamento e omogeneizzare la soluzione con lenta agitazione.
2. Dopo che tutte le cellule risospese vengono scongelate, regolare la soluzione a pH 9,0 per aumentare la solubilità della proteina in acqua ^12. Aggiungere 6 N NaOH goccia a goccia sotto agitazione su ghiaccio per ottenere una consistenza omogenea. Lyse dalla rottura ultrasuoni per 20 minuti sul ghiaccio con una punta piatta 2 mm di diametro, 5 sec impulso.
3. Centrifugare la soluzione di cellule a 12,000 xg per 30 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante di un ambiente pulito, una bottiglia vuota e conservare a 4 ° C per la purificazione dopo.
4. Nel frattempo, risospendere il pellet cellulare nuovo con TEN tampone e ri-congelamento a -80 ° C. Alisi cellulare completo, ripetizione gelo / disgelo e sonicazione processo fino a tre volte. Risparmia il 20 lisato cellulare microlitri per SDS-PAGE caratterizzazione.

5. Purificazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando Inverse transizione in bicicletta

1. Fascicola lisato cellulare dal punto 4.3 e procedere per purificare le proteine ​​all'AECM utilizzando ITC, simile a quello utilizzato per la purificazione di proteine ​​di ^elastina-21. Cicli saranno fatte con diverse temperature che sono di 4 ° C (indicati come "freddo") e 37 ° C (denominati "caldi"), cicli.
2. Dividere il lisato cellulare in 50 ml bottiglie centrifuga e centrifugare a 40.000 xg per 2 ore a 4 ° C. L'aspetto del pellet deve essere di colore marrone scuro e guardare che cola.
3. Rimuovere il surnatante pipettando per ottenere una netta separazione dal pellet. Raccogliere il supernatante in bottiglie da centrifuga puliti e aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 1 M (per un massimo di 3 M). Caldola soluzione a 37 ° C per 2 ore con agitazione a 225 rpm.
   NOTA: L'aggiunta di NaCl attiverà il passaggio della componente elastina dell'aggregazione causando AECM. Il surnatante diventerà torbido. Se la concentrazione proteica è sufficientemente elevata, proteine ​​schiumoso bianco può essere visto ai lati della bottiglia centrifuga.
4. Centrifugare il surnatante dal punto 5.3 a 40.000 xg per 2 ore a 37 ° C. Decantare il surnatante. Schiacciare il pellet con una spatola metallica e risospendere le bit pellet in acqua distillata autoclavata ghiacciata (50 mg / ml) con agitazione vigorosa O / N a 4 ° C utilizzando una ancoretta magnetica e la piastra. Il pellet dovrebbe essere completamente sciolto.
5. Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per altri tre a cinque volte per ottenere una maggiore purezza della proteina.
6. Dopo il ciclo finale di purificazione, desalificare la soluzione proteica da dialisi contro acqua distillata a 4 ° C. Dializzare soluzione proteica contro l'acqua per 2-3 giorni con i cambiamenti in acqua ogni 4hr o 8 ore per O / N. Invia 20 microlitri della proteina purificata per SDS-PAGE e liofilizzare il resto della proteina purificata e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.

6. Caratterizzazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando SDS-PAGE elettroforesi

1. Preparare un SDS-PAGE gel al 12% (se il peso molecolare è di grandi dimensioni, utilizzare 8% gel SDS-PAGE per una migliore separazione). Aggiungere 2x tampone di caricamento SDS a ciascun campione, riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C ed eseguire campioni sul gel per 1 ora a 100 V o finché la scala della proteina corrispondente al peso molecolare della proteina all'AECM raggiunge la metà del gel.
2. Recuperare il gel dalla SDS-PAGE configurare e aggiungere Coomassie Brilliant macchia blu (Tabella 2) con un volume di immergere il gel per 1 ora in una capsula di Petri. Gel risciacquo in una soluzione decolorante (Tabella 2) per 5 minuti su un agitatore meccanico. Cambiare la soluzione decolorante, e continuano a Decolorare il gel con dondolo fino al fondo della tegli gel diventa chiaro. Bande di proteine ​​devono essere chiaramente visibili.
3. Confrontare la posizione della proteina bersaglio contro la scala di proteine ​​per determinare il peso molecolare della proteina bersaglio.
4. Ad ulteriore conferma della presenza della proteina bersaglio, effettuare western blotting come al punto 7.

7. Caratterizzazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando Western Blotting

1. Eseguire i campioni su un SDS-PAGE gel al 12%, come nel capitolo 6, senza colorazione.
2. Tagliare membrana di nitrocellulosa a una dimensione leggermente più grande del gel SDS-PAGE. Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per le stesse dimensioni.
3. Wet un pezzo di carta da filtro con Transfer occidentale Buffer (20% v / v di metanolo, 25 mM Tris, 190 mM glicina, pH 8,3), collocare l'SDS-PAGE gel sulla parte superiore della carta da filtro, seguito da un altro foglio di carta da filtro , quindi la membrana di nitrocellulosa e una finale altre due pezzi di carta da filtro. Garantire l'intero set-up è sommersa con sufficiente buffer di trasferimento occidentale.
   NOTA: Il gel e membrane non devono essere in contatto, a questo punto di tempo come proteine ​​potrebbe legarsi alla membrana a contatto.
4. Trasferire le proteine ​​sulla membrana di nitrocellulosa posizionando due filtri di carta in una unità occidentale trasferimento semi-dry, seguita dalla membrana di nitrocellulosa, e posizionare accuratamente il gel SDS-PAGE all'interno e sulla membrana infine posizionare gli ultimi due carta da filtro umida sulla il gel SDS-PAGE. Eseguire il trasferimento occidentale a 45 mA, 30 min. Aggiungere tampone se la tensione è superiore a 30 V.
   NOTA: Preferibilmente posizionare la SDS-PAGE gel sulla membrana con un tentativo e evitare di spostare il gel inutilmente sulla membrana come proteine ​​potrebbe legarsi alla membrana a contatto.
5. Recuperare e bloccare la membrana di nitrocellulosa con una soluzione bloccante (5% latte scremato in PBS pH 7.4, filtrata con carta da filtro) per 2 ore a temperatura ambiente. Smaltire tampone di bloccaggio e aggiungere PBS per sciacquare.
   NOTA: Passare nuovi guanti per evitare di contaminare la membrana con prote indesideratiins.
6. Incubare primario anti-anticorpo con la sua diluizione in PBS a 1: 1.000 a temperatura ambiente per 1 ora con dondolo. Preparare una miscela in un volume tale da sommergere l'intera membrana, per esempio, con rapporto di diluizione 1: 1.000, aggiungere 1 ml di anticorpo (concentrazione magazzino: 1 mg / ml) a 999 ml di PBS per una miscela totale 1 ml.
7. Lavare la membrana con 5 ml di PBST (PBS con 0,1% Tween20).
8. Incubare con anticorpo secondario coniugato con rafano perossidasi (HRP) con diluizioni in PBS a 1: 5.000 a temperatura ambiente per 1 ora con dondolo. Preparare una miscela in un volume tale da sommergere l'intera membrana, per esempio, con rapporto di diluizione 1: 5.000, aggiungere 1 ml di anticorpo (concentrazione magazzino: 1 mg / ml) a 4,999 microlitri PBS per una miscela totale 5 ml.
9. Lavare la membrana con 5 ml di PBST e ripetere due volte.
10. Applicare il substrato chemiluminescente per la membrana con un volume per coprire la membrana e incubare seguendo le istruzioni del substrato utilizzato.
    NOTA: La sensibilità del substrato di rilevamento proteina può variare, si consiglia un substrato con la massima sensibilità per i segnali molto bassi in caso crescente concentrazione di anticorpi non aumenta i segnali.
11. Cattura i segnali chemiluminescenti utilizzando un sensore basato su telecamera CCD. Regolare il rapporto di diluizione anticorpo primario e secondario se i segnali sono deboli e non specifici. Incubare più nel bloccare soluzione se il segnale di fondo è alto.

Risultati

Nella progettazione di proteine ​​di fusione contenenti ripetizioni elastina simile, è importante mantenere un contenuto di elastina generale, abbastanza grande frazione della proteina di fusione ^18. Questo per garantire che il costrutto proteina di fusione mantiene le sue caratteristiche elastina simili, al fine di utilizzare ITC per la purificazione. Il design e le proteine ​​sequenze descritte in questa sezione AECM particolare sono stati presi dal lavoro di Tjin et al. ^14. In questo la...

Discussione

Ingegneria proteica ricombinante è una tecnica versatile per creare sostanze proteiche nuovi con un approccio bottom-up. I materiali a base di proteine ​​può essere progettato per avere funzionalità multiple, su misura secondo l'applicazione di interesse. A causa della crescente avanzamento nelle tecnologie di clonaggio e di espressione proteica, è diventato relativamente semplice (ed economico) per creare una varietà di proteine ​​artificiali in modo riproducibile e scalabile. Il dominio elastina-like è stata incor...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pET22b (+)	Novagen	69744	Vettori di espressione T7 con resistenza all'ampicillina
BL21(DE3)pLysS	Antibiotici aggiuntivi Invitrogen	C6060-03	- cloramfenicolo
Isopropil-beta-D-tiogalattoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M soluzione madre con acqua autoclavata, fare fresco prima dell'induzione.
Kit QIAprep Spin Miniprep Kit	di isolamento plasmidico	Qiagen	27106
Ligasi T4	New England Biolabs	M0202S
Ampicillina	Affymetrix	11259
Cloramfenicolo	Affymetrix	23660
Kit di recupero del DNA in gel	Zymo Research	D4001
XL10-ceppo	d'oroTecnologie Agilent 200315