Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Alzahra J. Al Omran; Hannah C. Saternos; Tongyu Liu; Surya M. Nauli; Wissam A. AbouAlaiwi

doi:10.3791/52853

Articolo metodologico

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

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DOI:

10.3791/52853

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1 giugno 2015

Alzahra J. Al Omran¹ , Hannah C. Saternos¹ , Tongyu Liu² , Surya M. Nauli³ , Wissam A. AbouAlaiwi¹

¹Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, ²Life Sciences Institute, University of Michigan, ³Department of Biomedical & Pharmaceutical Sciences, Chapman University, School of Pharmacy, Rinker Health Science campus

In questo articolo

Sommario

Utilizzando ad alta risoluzione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, un ex vivo osservazione del battito di ciglia motile ependimale situato all'interno il mouse ventricoli cerebrali è dimostrata dal live-imaging. La tecnica consente una registrazione della frequenza battito ciliare unico e battendo angolo come pure i loro calcio intracellulare proprietà oscillazione stimolazione.

Abstract

Cellule ependimali Multiciliated linea i ventricoli del cervello adulto. Funzione o la struttura di ciglia ependimali anormale è associata con vari deficit neurologici. L'attuale ex vivo imaging dal vivo di motilità tecnica cilia ependimale consente per uno studio dettagliato delle dinamiche ciliari dopo diversi passaggi. Questi passaggi sono: topi eutanasia con anidride carbonica secondo i protocolli della University of Institutional cura di Toledo degli animali e del Comitato uso (IACUC); craniectomy seguita dalla rimozione del cervello e sagittale dissezione del cervello con un vibratomo o lama affilata di ottenere sezioni molto sottili attraverso i ventricoli laterali del cervello, dove le ciglia ependimale possono essere visualizzati. L'incubazione delle fette del cervello in una lastra di vetro-bottom personalizzata contenente Modified Eagle Medium (DMEM) / High-Glucosio Dulbecco a 37 ° C in presenza di 95% / 5% O ₂ / CO miscela ₂ è essenziale per mantenere vivo il tessuto durantel'esperimento. Un video del pestaggio cilia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. Il video viene poi analizzato fotogramma per fotogramma per calcolare la frequenza ciliare pestaggio. Questo permette la classificazione distinta delle cellule ependimali in tre categorie o tipi in base alla loro frequenza di battito ciliare e l'angolo. Inoltre, questa tecnica permette l'uso dell'analisi fluorescenza ad alta velocità per caratterizzare le proprietà uniche intracellulari oscillazione calcio di cellule ependimali, nonché l'effetto di agenti farmacologici sulle oscillazioni di calcio e la frequenza di battito ciliare. Inoltre, questa tecnica è adatto per immunofluorescenza di imaging per studi di struttura ciliare e localizzazione della proteina ciliare. Ciò è particolarmente importante in studi diagnosi della malattia e fenotipo. Il limite principale di questa tecnica è attribuita alla diminuzione in vivo movimento cilia motilità come il tessuto cerebrale inizia a morire.

Introduzione

Cilia sono organelli basato microtubuli sensoriali che si estendono dalla superficie cellulare per l'ambiente extracellulare. A seconda della loro organizzazione dei microtubuli, ciglia possono essere classificati in due tipi - "9 + 0" o "9 + 2". Funzionalmente, sulla base della loro motilità, questi possono essere classificati come motile o non mobili cilia ^1. Cilia primaria è un termine comunemente usato per indicare "9 + 0" cilia non mobili. Questi hanno nove microtubuli doppietto parallele (indicati con '9') e una coppia centrale di microtubuli è presenta all'interno della guaina centrale (indicato con '0'). Tuttavia, alcuni "9 ....