Questo protocollo descrive come silenziare temporaneamente e a distanza l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre i ratti sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina la farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) progettato per distinguere tra diverse componenti dell'apprendimento.
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Articolo metodologico
Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive come disattivare temporaneamente e in remoto l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-droga) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) che è stato progettato per distinguere tra le diverse forme di apprendimento. In particolare, la consegna virale-mediata è usato per esprimere un recettore G-proteina inibitrice geneticamente modificata accoppiata (Progettazione Receptor) in una regione del cervello discreta nei roditori. Tre settimane più tardi, quando i livelli di espressione del recettore del progettista sono alti, un agente farmacologico (Designer Drug) viene somministrato per via sistemica 30 minuti prima di una sessione specifica del comportamento. Il farmaco ha affinità per il recettore progettista e pertanto provoca l'inibizione di neuroni che esprimono il recettore progettista, ma è altrimenti biologicamente inerte. La regione del cervello rimane a tacere per 2-5 ore (Depending dalla dose e via di somministrazione). Al termine del paradigma comportamentale, tessuto cerebrale viene valutata per il corretto posizionamento e l'espressione del recettore. Questo approccio è particolarmente utile per determinare il contributo di regioni cerebrali singoli componenti specifici di comportamento e può essere utilizzato in qualsiasi numero di paradigmi comportamentali.
Introduzione
Una sfida emozionante nel campo delle neuroscienze del comportamento è quello di determinare i substrati neurali di comportamenti complessi. Un certo numero di tecniche come lesioni permanenti, inattivazione cervello temporaneo tramite impianti cannule e optogenetics sono stati impiegati per identificare i contributi di regioni cerebrali discreti per sottocomponenti di comportamenti complessi. Mentre questi approcci informano la nostra comprensione della specificità regionale durante l'apprendimento, ogni tecnica non è senza limiti. In particolare, le lesioni permanenti sono tipicamente condotte prima della prova comportamentale, quindi sono presenti in tutta la ....
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Protocollo
L'uso di animali sono approvati dalla Oberlin College Istituzionale Animal Care and Use Committee e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio 21.
1. Preparazione per Infusione virale
Nota: Questo protocollo utilizza BSL-1 precauzioni. Quando si impiegano BSL-2 precauzioni, un camice da laboratorio e getta, guanti, copriscarpe, protezioni oculari e un respiratore per particolati (tipo N95) sono obbligatori. Tutte le persone manipolazione BSL-2 composti devono essere adatti testato per un respiratore per particolati da un'agenzia sanitaria locale. Fare riferiment....
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Risultati
Risultati comportamentali
Al termine dell'esperimento, l'efficacia della inattivazione temporanea regione specifica deve essere valutata quantitativamente e qualitativamente. Il presente esempio riguarda un paradigma 3 fasi comportamentale (precondizionamento sensoriale), in cui è stato somministrato CNO attenuare attività neurale nel RSC durante le sessioni di precondizionamento per verificare l'ipotesi che la RSC è necessario per la formazione di associazioni tra stimoli neutro
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Discussione
Questo protocollo descrive come applicare un approccio farmacogenetica (DREADD) per studiare come una regione del cervello specifica contribuisce ad un più fasi compito di apprendimento complesso. Con la possibilità di disattivare temporaneamente e in remoto attività neurale in regioni cerebrali distinte attraverso fasi di apprendimento, questa combinazione di approcci fornisce una piattaforma per indagare su una vasta gamma di comportamenti, tra cui forme più sfumate o mascherate di apprendimento. Nell'esempio desc.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo di Robinson et al. 12 gli autori per il loro contributo il manoscritto da cui questo protocollo è parzialmente derivato.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Maschio, ratti Long Evans, 55-60 giorni di età | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Attenzione: questo è un composto BSL-1 | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Attenzione: questo è un composto BSL-1 | |
| clozapina-N-ossido | R& D Systems | 4936-10 | Coperchio |
| gabbia per ratti (policarbonato) | Design alternativo | FT 8XL-PC | Utilizzato per coprire le gabbie degli animali 48-72 ore dopo l'infusione |
| da filtro (ricambio) | Design alternativo | FP-R-1018XAD | Carta da filtro che si abbina ai coperchi delle gabbie |
| Morsa da tavolo | JETS | 2201-265 | Per contenere provette per microcentrifuga contenenti AAV nel cofano |
| Sacchetti per la spazzatura a rischio biologico | Graffette | 113444 | Fodere per rischi biologici Medline Pattumiera |
| a rischio biologico | United Solutions 34 galloni rettangolare con ruote | ||
| maniglia Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anestetico |
| Doppio stereotassico per piccoli animali con console di lettura del display digitale | David Kopf | Modello 942 | Attrezzature chirurgiche |
| Barre auricolari non rotte, set di 2 (ratto) | David Kopf | Modello 955 | Attrezzatura chirurgica |
| Maschera per anestesia (ratto) | David Kopf | Modello 906 | Attrezzatura chirurgica |
| Il trapano stereotassico ad alta velocità include il controller del motore da tavolo, il pedale, il manipolo, il supporto del manipolo stereotassico | David Kopf | Modello 1474 | Attrezzature chirurgiche |
| Frese per microdrill, 0,9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Fornitura chirurgica |
| Pompa a siringa automatizzata con controller micro4 | David Kopf | Modello UMP3-1 | Attrezzatura chirurgica |
| Lama in ceramica staccabile per animali kit clipper | Ahdis | 21420 | Fornitura chirurgica |
| Betadine detergente per la pelle | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Fornitura chirurgica |
| Triplo unguento antiobiotico Medline | Supply | 53329-087-01 | Fornitura chirurgica |
| Puralube unguento | veterinario Solo fornitura veterinaria | 17033-211-38 | Fornitura chirurgica |
| Microscopio | Dino-liteAD7013MTL | Un'alternativa al tradizionale cannocchiale di dissezione | |
| Supporto rigido da tavolo Dino-lite | Microscopio | MS36B | Attrezzatura chirurgica |
| 28 G 10 μ l siringa | Hamilton | 80308-701SN | Attrezzatura chirurgica |
| Cabina acustica extra alta in MDF | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' L x 22" A x 16" P |
| Camera di prova modulare extra alta | Med Associates, Inc | ENV-007 | Attrezzatura comportamentale |
| Pavimento a griglia in acciaio inossidabile | Med Associates, Inc | ENV-005 | Attrezzatura |
| comportamentaleLuce domestica | Med Associates, Inc | ENV-215M | Utilizzato come luce domestica e luce di stimolo |
| Distributore di pellet modulare | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Attrezzatura comportamentale |
| Recipiente per pellet, tipo a tazza | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Apparecchiatura comportamentale |
| Rilevatore di ingresso nella testa per ratto | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Attrezzatura comportamentale |
| Pellet alimentari di precisione senza polvere, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Alimentazione comportamentale |
| Altoparlante a gabbia per camera di ratto | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Apparecchiature comportamentali |
| Generatore audio programmabile | Med Associates, Inc | ANL-926 | Apparecchiature comportamentali |
| Smart ctrl 8 ingressi/16 uscite | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Apparecchiature comportamentali |
| Armadio da tavolo di grandi dimensioni e alimentatore | Med Associates, Inc | SG-6510D | Apparecchiature comportamentali |
| Pacchetto di interfaccia PCI | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Apparecchiature comportamentali |
| MED Intel core computer pkg con monitor X Pro da 19" | Med Associates, Inc | COM-103V | Apparecchiature comportamentali |
| Paraformaldeide (granulare), 1 kg | Microsopia elettronica Scienze | 19210 | Pericolo: cancerogeno, pesare nel cappuccio |
| Anticorpo monoclonale di coniglio (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Reagente istologico |
| XP Anticorpo monoclonale di coniglio (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Reagente istologico |
| IgG anti-coniglio | Cell Signaling Technologies | 4412S | Forniture istologiche |
| Superfrost plus vetrini | VWR international | 483111-703 | Forniture per istologia |
Riferimenti
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L.
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Ristampe e permessi
