Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.
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Articolo metodologico
Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule somatiche possono essere riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forzando l'espressione di quattro fattori di trascrizione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), tipicamente espressa da cellule staminali embrionali umane (hESC) . A causa della loro somiglianza con hESC, iPSCs sono diventati uno strumento importante per il potenziale di medicina rigenerativa paziente-specifici, evitando questioni etiche connesse con hESC. Al fine di ottenere cellule adatte per l'applicazione clinica, iPSCs senza transgene devono essere generati per evitare transgene riattivazione, alterata espressione genica e differenziazione sbagliata. Inoltre, un metodo di riprogrammazione molto efficiente e conveniente è necessario ricavare iPSCs sufficienti a fini terapeutici. Tenuto conto di questa esigenza, un approccio efficiente non integrando episomiale plasmide è la scelta preferibile per IPSC derivazione. Attualmente il tipo di cella più comune utilizzato per scopi di riprogrammazione sono fibroblasti, l'isolamento dei quali richiede biopsia tissutale, un iprocedura chirurgica nvasive per il paziente. Pertanto, sangue periferico umano rappresenta il tessuto più accessibile e meno invasivo per la generazione IPSC.
In questo studio, un protocollo virale senza costo-efficacia e l'utilizzo non integrano plasmidi episomiale è segnalato per la generazione di iPSCs dal periferico cellule umane mononucleate del sangue (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati dopo centrifugazione del sangue intero e senza la densità di separazione gradiente.
Introduzione
Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka 1 ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall'espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all'....
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Protocollo
Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMNCs) sono stati isolati da campioni di sangue periferico di donatori sani, dopo firmato il consenso informato e l'approvazione del Comitato Etico della Provincia di Bolzano. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo anonimo.
1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs)
- PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
- Raccogliere 8 mL di sangue periferico venoso in un ....
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Risultati
In questo studio un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs-virali libero da riprogrammazione della PBMNCs isolati da buffy coat congelati dopo centrifugazione del sangue intero e confronto con riprogrammazione della PBMNCs ottenute dopo la separazione gradiente di densità è riportato. La figura 1A mostra una rappresentazione schematica di il protocollo dettagliato. Dopo lo scongelamento, i PBMNCs isolato, mostrando una tipica forma arrotondata, vengono espanse in specifico terreno d.......
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Discussione
In passato, l'unico modo per ottenere cellule staminali pluripotenti umane che trasportano una particolare mutazione genetica è stato quello di reclutare genitori sottoposti a diagnosi genetica pre-impianto e generare cellule staminali embrionali da loro blastocisti scartate 31,32. Utilizzando un approccio riprogrammazione, i ricercatori possono ora generare iPSCs di pazienti portatori di praticamente qualsiasi genotipo. La possibilità di partire da una linea cellulare paziente-specifica ed una fonte faci.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dal Ministero della Salute e dal Dipartimento dell'Assistenza Educativa, Università e Ricerca della Provincia Autonoma di Bolzano e dalla Fondazione Sparkasse dell'Alto Adige.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Citrato di sodio tamponato Venosafe Tubo di plastica | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Cloruro di ammodio | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Bicarbonato di potassio | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA polvere disodica | Sigma-Aldrich | E5134 | 0,5 M soluzione |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Soluzione di polisaccarosio per centrifugazione |
| gradiente di densità Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No fenolo rosso |
| prosciutto F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| insulina-transferrina-selenio-etanolammina (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Concentrato lipidico chimicamente definito | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Tioglicerina | Sigma-Aldrich | M6145 | Concentrazione finale a 200 µ |
| M Fattore di cellule staminali umane ricombinanti (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µ g/ml) |
| Interleuchina-3 umana ricombinante (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µ g/ml) |
| Fattore di crescita insulino-simile umano ricombinante (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µ g/ml) |
| Eritropoietina umana ricombinante (EPO) | R& Sistemi D | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μ M (A magazzino: 1 mM) |
| Olotransferrina umana | R& Sistemi D | 2914-HT | 100 μ g/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco 11269016 | Terreno per analisi citogenetiche | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Terreno per colture iPSC senza alimentatore |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Siero sostitutivo | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutammina (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Butirrato di sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 m) |
| FGF umano ricombinante basico, 145 aa | R& Sistemi D | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µ g/ml) |
| Y-27632 dicloridrato | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µ M (Stock: 10 mM) |
| Siero bovino definito fetale | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0,1% Soluzione di gelatina | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD | Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Tipo IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Soluzione di distacco cellulare |
| Fibroblasto embrionale di topo (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 pozzetti |
| piastra Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µ g (Stock: 1 µ g/µ l) |
| Plasmide pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l) |
| Plasmide pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l) |
| Plasmide pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l) |
| Kit di colorazione della fosfatasi alcalina | Stemgent | 00-0009 | |
| Anticorpo anti-antigene embrionale specifico per stadio-4 (SSEA-4) | MAB4304 | 1/250 | |
| Anticorpo anti-TRA-1-60 | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anticorpo Anti-Oct-3/4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anticorpo anti-nanog | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anticorpo anti-troponina I | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anticorpo anti-alfa-actinina (sarcomerico) | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Classe neuronale III ß-Tubulina (TUJ1) | Anticorpo Covance Prodotti di ricerca Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH) | Calbiochem | 657012 1/200 | |
| Alexa Fluor 488 Capra anti-topo | Sonde molecolari | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Sonde molecolari anti-coniglio di capra | A-21429 | 1/1000 | |
| Piastra per colture cellulari a bassissimo attaccamento | Corning | 3471 | |
| Reagente Trizol | Ambion | 15596-018 | reagente per l'estrazione dell'RNA |
| Kit di sintesi del cDNA SuperScript VILO | Invitrogen | 11754050 | Kit di trascrittasi inversa |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Sistema di rilevamento PCR in tempo reale | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Sistema di elettroforesi automatizzato | Bio-Rad | 700-7000 | Strumento per verificare l'integrità dell'RNA |
| Experion RNA Kit di analisi Highsense | Bio-Rad | 7007105 | Kit di reagenti per verificare l'integrità dell'RNA |
| Microscopio da dissezione (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonSistema di trasfezione 100 &; l Kit | Invitrogen | MPK10025 | Kit di reagenti per elettroporazione |
| Sistema di trasfezione al neon | Invitrogen | Strumento utilizzato per l'elettroporazione | |
| Spettrofotometro UV/Vis NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | Strumento per la quantificazione di DNA/RNA |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Kit di purificazione dei plasmidi |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from f....
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Ristampe e permessi
