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Articolo metodologico

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

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DOI:

10.3791/52885

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5 giugno 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Abstract

Cellule somatiche possono essere riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forzando l'espressione di quattro fattori di trascrizione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), tipicamente espressa da cellule staminali embrionali umane (hESC) . A causa della loro somiglianza con hESC, iPSCs sono diventati uno strumento importante per il potenziale di medicina rigenerativa paziente-specifici, evitando questioni etiche connesse con hESC. Al fine di ottenere cellule adatte per l'applicazione clinica, iPSCs senza transgene devono essere generati per evitare transgene riattivazione, alterata espressione genica e differenziazione sbagliata. Inoltre, un metodo di riprogrammazione molto efficiente e conveniente è necessario ricavare iPSCs sufficienti a fini terapeutici. Tenuto conto di questa esigenza, un approccio efficiente non integrando episomiale plasmide è la scelta preferibile per IPSC derivazione. Attualmente il tipo di cella più comune utilizzato per scopi di riprogrammazione sono fibroblasti, l'isolamento dei quali richiede biopsia tissutale, un iprocedura chirurgica nvasive per il paziente. Pertanto, sangue periferico umano rappresenta il tessuto più accessibile e meno invasivo per la generazione IPSC.

In questo studio, un protocollo virale senza costo-efficacia e l'utilizzo non integrano plasmidi episomiale è segnalato per la generazione di iPSCs dal periferico cellule umane mononucleate del sangue (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati dopo centrifugazione del sangue intero e senza la densità di separazione gradiente.

Introduzione

Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka 1 ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall'espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all'uso di hESC e bypass possibile rigetto immunitario 3. Così, iPSCs appaiono come una delle più importanti fonti di cellule paziente-specifiche per la ricerca di base, lo screening di stupefacenti, modelli di malattia, la valutazione della tossicità, e fini di medicina rigenerativa 4.

Diversi approcci sono stati utilizzati per la generazione iPSC: vettori virali integrazione(Retrovirus 5, lentivirus 6), virale non integrando vettori (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC trasposoni 9, vettori episomiale 10, proteine ​​11 o consegna RNA 12. Sebbene l'uso di metodi di virus-mediata può portare ad alta efficienza riprogrammazione, vettori virali integrano nel genoma delle cellule ospiti e quindi potenziale casuale mutagenesi inserzionale, alterazione permanente di espressione genica, e la riattivazione di transgeni tacere durante la differenziazione non può essere esclusa 13.

Per rendere più sicuro iPSCs per la medicina rigenerativa, sono stati compiuti sforzi per derivare iPSCs senza l'integrazione di DNA esogeno in genomi cellulari. Sebbene siano stati sviluppati vettori virali soggetti ad accisa e trasposoni, è ancora chiaro se sequenze vettore brevi, che inevitabilmente rimangono nelle cellule trasdotte dopo escissione e transposase espressione, potrebbero indurre alterazioni nella cellalare funzionano 13. Nonostante la sua alta efficienza riprogrammazione, virus Sendai rappresenta un approccio costoso e raggiungere, attraverso problemi di licenza con la società che ha sviluppato questo sistema di avere il potenziale per limitarne l'applicazione negli studi traslazionali. Inoltre, la necessità di introduzione diretta di proteine ​​e RNA richiede consegna multiplo di riprogrammazione molecole con le limitazioni tecniche insite questo introduce, e l'efficienza complessiva riprogrammazione è molto bassa 14. Di nota, metodi virali libere e non integrare convenienti basate sull'uso di plasmidi episomiale sono stati riportati con successo per la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei 15. In particolare, in questo lavoro abbiamo deciso di utilizzare commerciali plasmidi episomiale senza integrazione disponibili, come riportato in precedenza 10,15.

Fino ad oggi, fibroblasti cutanei rappresentano il più popolare tipo di cellula donatrice 5. Tuttavia, altre fonti di cellule sono stati successfully riprogrammato in iPSCs compresi cheratinociti 16, del midollo osseo cellule staminali mesenchimali 17, cellule stromali adipose 18, follicoli piliferi 19, e le cellule della polpa dentale 20. L'isolamento di queste cellule richiede procedure chirurgiche, e diverse settimane sono necessari per l'espansione delle cellule in vitro allo scopo di stabilire una coltura cellulare primaria.

In questa luce, la selezione del tipo di cellula di partenza è critico ed è altrettanto importante essere in grado di produrre iPSCs dai tessuti facilmente accessibili e meno invasive come sangue. Entrambe le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMNCs) 21,22 e cellule mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) 14,22-24 rappresentano idonee fonti di cellule per la derivazione di iPSCs.

Sebbene l'efficienza di adulti PBMNC riprogrammazione è 20-50 volte inferiore a quella del CBMNCs 22, rimangono il tipo di cella più conveniente per scopo campionamento. InInfatti, campionamento PBMNC ha il vantaggio di essere minimamente invasiva, e in aggiunta, queste cellule non richiedono vasta espansione in vitro prima degli esperimenti di riprogrammazione. Fino ad oggi, i protocolli differenti hanno riferito che PBMNCs dopo la separazione gradiente di densità possono essere congelati e scongelati giorni a diversi mesi dopo il congelamento e ampliato per alcuni giorni prima della riprogrammazione in iPSCs 22,23. Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza segnalazioni hanno descritto una riprogrammazione della PBMNCs da buffy coats congelati. È importante sottolineare che, buffy coats congelati raccolti senza separazione gradiente di densità rappresentano i campioni di sangue più comuni memorizzati nella biobanche di grandi dimensioni provenienti da studi di popolazione, rappresentando così una piscina facilmente accessibile di materiale per la produzione di IPSC che evita ulteriormente la raccolta dei campioni.

Qui riportiamo per la prima volta la generazione di iPSCs-virali privi di buffy coats congelati umani, sulla base di un protocollo precedentemente descritto 22. InInoltre, sono stati generati da iPSCs PBMNCs congelati ottenuti dopo la separazione gradiente di densità, come un protocollo di controllo per i risultati PBMNC gradiente di densità non depurati.

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Protocollo

Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMNCs) sono stati isolati da campioni di sangue periferico di donatori sani, dopo firmato il consenso informato e l'approvazione del Comitato Etico della Provincia di Bolzano. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo anonimo.

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs)

  1. PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
    1. Raccogliere 8 mL di sangue periferico venoso in un citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a RT (25 ° C). Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
    2. Centrifugare la provetta a 2.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore secchio oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
    3. Raccogliere nuvoloso buffy coat (strato tra la fase di plasma superiore e quella inferioreFase contenente la maggior parte degli eritrociti), contenente la frazione PBMNC arricchito (500 microlitri) in una provetta esageratamente.
    4. Risospendere 500 ml di buffy coat con 500 pl di mezzo 2x congelamento contenente 90% FBS e 20% DMSO, in modo da ottenere un volume totale di 1 ml con concentrazione DMSO 10%.
    5. Blocca il flacone in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.
  2. PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
    1. Raccogliere 12 ml di sangue periferico venoso in citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a temperatura ambiente. Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
    2. Diluire il sangue con PBS sterile fino ad un volume finale di 35 ml.
    3. Cautela e lentamente, strato 35 ml di sangue diluito su 15 ml di soluzione di polysucrose (utilizzata per la separazione gradiente di densità) (p = 1.077) in una provetta conica da 50 ml (rapporto 3: 1).
    4. Centrifugare la provetta a 800 xg per 30 min a RTun rotore bucket oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
    5. Aspirare la parte superiore, la fase gialla contenente plasma ed eliminarla. Cautela, trasferire lo strato interfase bianco opaco contenente PBMNCs in una nuova provetta conica da 50 ml.
    6. Portare il volume totale di 30 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
    7. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 30 ml di PBS. Contare il numero di cellule vitali, sulla base di trypan esclusione blu 25.
    8. PBMNCs centrifuga a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e gettarlo.
    9. Risospendere il pellet di cellule in una quantità appropriata di medie congelamento contenente 90% FBS e 10% DMSO, in modo da ottenere una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml.
    10. Aliquotare 1 ml per flacone (circa 5 x 10 6 cellule / ml) e congelare la fiala in un tasso controllato congelamento contenitore a - 80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.

2. di scongelare e placcatura di PBMNCs (DAY 0)

  1. PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
    1. Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs di buffy coat congelati, scongelare 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C e diluire il buffy coat con PBS sterile fino ad un volume finale di 2 ml.
    2. Trasferire il buffy coat diluito in una provetta da 50 ml, aggiungere 10 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Per preparare 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungere 0,5 g di bicarbonato di potassio, 4.145 g di cloruro di ammonio, 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA a 500 ml di acqua ultrapura, pH 7,2-7,4.
    4. Portare il volume totale di 50 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
    5. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 50 ml di PBS sterile, centrifugare il buffy coat a 300 xg per 10 min a RT.
    6. Risospendere le cellule in1 ml di PBMNC media, come precedentemente descritto 22, composto da: IMDM e di Ham F-12 (rapporto 1: 1), 1% di insulino-transferrina-selenio-Etanolammina (ITS-X), l'1% di chimica definita Concentrato Lipid (CDL), 1% penicillina / streptomicina, 0,005% di acido L-ascorbico, lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 1-thioglycerol (concentrazione finale 200 micron), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleuchina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor IGF-1 (40 ng / ml), desametasone (1 pM) e holo-transferrina (100 ug / ml ).
    7. Trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).
  2. PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
    1. Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs congelati dopoDensità separazione in gradiente, disgelo 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C, trasferire le cellule in 5 ml di PBMNC media. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
    2. Risospendere le cellule in 1 ml di PBMNC medio e trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).

3. Cultura ed espansione di PBMNCs (DAY 2-13)

  1. Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con una punta 1 ml, in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
  2. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno PBMNC fresco.
  3. Trasferire le cellule in 1 pozzetto della piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
  4. Ripetere la procedura ogni due giorni, e dividere le celle in un rapporto di 1: 2 quando raggiungono la confluenza appropriata (circa l'80%).

4. La trasfezione di PBMNCs con episomiale plasmidi (DAY 14)

Nota: Eseguire l'isolamento dei quattro plasmidi episomiale senza intergation commerciali, portando i geni pluripotenziali utilizzando un kit commerciale di purificazione plasmide e valutare la qualità dei plasmidi purificati utilizzando un'analisi gel di agarosio, secondo le istruzioni del produttore.

  1. Raccogliere PBMNCs in tubo da 15 ml e contare il numero di cellule vitali (sulla base del trypan blue) 25.
  2. Centrifuga 2 x 10 6 cellule a 300 xg per 10 min a RT.
  3. Risospendere 2 x 10 6 cellule in mix trasfezione contenente 100 ml di Resuspension Buffer T e 1 mg di ciascun DNA plasmide (una plasmide portando Oct3 / 4 e shRNA contro p53, un plasmide portando SOX2 e Klf4, unoplasmide portando L-MYC e LIN28, e un plasmide portando EGFP, per verificare l'efficienza di trasfezione).
  4. Aspirare il mix trasfezione contenente le cellule in una punta microlitri 100 e inserire la pipetta con il campione verticalmente nel tubo, riempito con 3 ml di tampone elettrolitica E2, nella stazione pipetta di macchina elettroporazione, secondo le istruzioni del produttore.
  5. Le cellule in modo efficiente l'elettroporazione utilizzando il seguente programma: 1.650 V, 10 msec, 3 impulsi.
  6. Risospendere le cellule elettroporate (2 x 10 6 cellule) in 2 ml di pre-riscaldato medio PBMNC, aggiungendo 0,25 mM sodio butirrato (NaB) e contare il numero di cellule vitali dopo protocollo elettroporazione (sulla base del trypan blue) 25.
  7. Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti senza rivestimento, agitare delicatamente la piastra e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
  8. Il giorno dopo elettroporazione, Count il numero di cellule GFP-positive al microscopio a fluorescenza 8-10 campi casuali, al fine di valutare l'efficienza di trasfezione.
  9. Mantenere le cellule transfettate senza suddivisione per 3 giorni, fino a quando li placcatura sul MEF (vedi Sezione 6).
  10. Sostituire 2 ml di PBMNCs fresco medio, più 0,25 NAB mM ogni due giorni.

5. Preparare Piatti con Feeder cellule per la co-coltura (DAY 16)

  1. Coat i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di matrice membrana basale per 15 min a 37 ° C e la piastra di fibroblasti embrionali di topo (MEF) ad una densità di 2 x 10 5 cellule / pozzetto con 2 ml di 10% FBS conteneva DMEM (MEF medio) un giorno prima passaging le PBMNCs elettroporate sul feeder cellule MEF.

6. placcatura trasfezionati PBMNCs sul MEF (DAY 17-19)

  1. Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con 1 ml punta, in tubo da 15 ml e centrifugare transfettate PBMNCs a 300 xg per 10 mina RT.
  2. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di terreno PBMNC fresco, più lo 0,25 NaB mm.
  3. Piastra le cellule su MEF rivestite 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
  4. Dopo due giorni, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml di IPSC medio composto da knockout DMEM (KO-DMEM), il 20% KO-siero sostituzione (KOSR), 1 NEAAs mm, 1% penicillina / streptomicina, 20 mm L- glutammina, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng FGF / ml (bFGF base) e 0,25 NaB mm.
  5. Sostituire 2 ml di fresco medio iPSC ogni giorno e controllare le celle al giorno.
    Nota: A circa 22-25 giorni, le prime colonie di iPSCs dovrebbero essere visibili.

7. Raccolta e l'espansione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Clones (DAY 30-35)

Nota: A circa 30-35 giorni dopo la trasfezione, le colonie IPSC dovrebbero essere pronti per la raccolta e replating. L'efficienza riprogrammazione dovrebbe essere estiaccoppiato come la percentuale del numero di colonie IPSC / numero totale di cellule elettroporate, come riportato in precedenza 26.

  1. Il giorno prima passaging colonie IPSC, preparare l'alimentatore MEF in un 12-pozzetti (1,25 x 10 5 cellule / pozzetto).
  2. Aspirare il mezzo di MEF e cambiare con 1 ml di IPSC media con 10 ng / ml bFGF e 10 micron Y-27632. Sezionare manualmente con un ago una colonia in ogni volta sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappa per ottenere una griglia, raccogliere piccoli grumi pipettando e trasferire singolarmente ciascuna in un pozzetto della piastra 12 pozzetti rivestiti con MEF.
  3. Passaggio ed espandere ciascuna piastra 12 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti in un rapporto 1: 2, allora ogni 6 pozzetti in un rapporto 1: 4 per ulteriore moltiplicazione. Sezionare e ampliare iPSCs manualmente per i primi 2-3 passaggi (come ben descritto nella fase 7.2), quindi utilizzare una procedura enzimatica dissociazione (iniziare dal punto 7.4).
  4. Per un protocollo enzima dissociazione, pulito iPSC colonies aspirando porzioni differenziati, al microscopio da dissezione alla raccolta cofano.
  5. Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
  6. Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aspirare il surnatante, risospendere le colonie in 2 ml di COPSI media con 10 ng / ml bFGF e 10 pM Y-27632 e piatto su MEF rivestite 6 pozzetti (rapporto 1: 4).

8. Caratterizzazione di iPSCs (tra 5-15 Passages)

  1. Fosfatasi alcalina Colorazione
    1. Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
    2. Per iniziare un protocollo di fosfatasi alcalina di colorazione, sciacquare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di 4% PFA per 20 minuti a RT.
    3. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
    4. Macchia fisso celle usandoun kit commerciale alcalina fosfatasi colorazione in base alle istruzioni del produttore.
  2. Immunofluorescenza
    1. Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
    2. Per avviare un test di immunofluorescenza, lavare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
    4. Trattare iPSCs fissate con 1 ml di permeabilizzazione / blocco soluzione contenente siero di capra 4%, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 e 0,05% di sodio azide (NaN 3) per 1 ora a RT.
    5. Aspirare la soluzione di saturazione e incubare le cellule fissate con anticorpi primari a 3% di BSA e 0.05% NaN 3 soluzione O / N a 4 ° C (controllare la tabella materiale per la lista anticorpo primario e ha suggerito di anticorpi fattore di diluizione).
    6. Il giorno dopo, lavare iPSCs tre volte con PBS, poi incubare le cellule con Alexa Fluor 488 capra anti-topo e Alexa Flanticorpi anti-coniglio di capra UOR 555, diluito 1: 1000 in 3% BSA e 0,05% NaN soluzione 3, per 1 ora a 37 ° C.
    7. Macchiare i nuclei con DAPI (1 ug / ml) per 10 minuti a RT in scuro, seguito da tre lavaggi con PBS tempo.
  3. Differenziazione dei iPSCs a corpi embrionali (EBS)
    1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
    2. Rimuovere parti differenziate da colonie IPSC aspirando, sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappuccio.
    3. Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
    4. Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
    5. Aspirare il surnatante e risospendere le colonie in 2 ml di EB mezzo composto KO-DMEM, 20% definito di siero fetale bovino (FBS), 1 NEAAs mM, 1% di penicillina / streptomicina, 20 mM L-glutammina, 0,1 mM46; -mercaptoetanolo.
    6. Piatto colonie IPSC in sospensione per 6 giorni su fissaggio 6 pozzetti ultra-bassa, in modo da consentire la formazione di sferoidali corpi embrionali tridimensionali (EBS). Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
    7. Il giorno 7, raccogliere EBs e piastra sul 0,1% di gelatina rivestito 6 pozzetti in 2 ml di EB medio e mantenere EBs nella differenziazione per 20 giorni.
    8. Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
  4. qRT-PCR per l'espressione genica di analisi
    1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
    2. Estratto RNA totale da PBMNCs, iPSCs o EBs utilizzando 1 ml di reattivo commerciale in conformità con le istruzioni del produttore.
    3. Valutare la concentrazione di RNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti> 1.8) 27.
    4. ControllareIntegrità dell'RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore (di alta qualità RNA RQI> 9.5) 28.
    5. Eseguire una reazione di trascrizione inversa in 1 mg di RNA totale utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale secondo le istruzioni del produttore.
    6. Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di cDNA, 7,5 ml SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29.
    7. Eseguire la qRT-PCR utilizzando il seguente programma: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 minuti, seguito da 40 cicli suddivisi in una fase di denaturazione a 95 ° C per 15 sec e di primer ricottura ed estensione fase a 60 ° C per 45 sec 29.
    8. Normalizzare l'espressione di altri geni che utilizzano GAPDH come le pulizie gene 28 (vedi i primer elencati nella tabella 1).
  5. qPCRper Transgene Esclusione
    1. Estrarre il DNA da PBMNCs o iPSCs utilizzando 1 ml di buffer di lisi contenente 50 mM Tris, EDTA 100 mm, NaCl 100 mm, 1% sodio dodecilsolfato (SDS) e 20 mg / ml proteinasi K.
    2. Aggiungere un volume uguale (1 ml) di 100% isopropanolo, miscelare capovolgendolo tre volte al fine di consentire la precipitazione del DNA e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Eliminare il supernatante, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere in / acqua priva di DNasi RNasi.
    4. Valutare la concentrazione del DNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A 260 / A 280 e A 260 / A 230 rapporti> 1.8) 27.
    5. Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di DNA stampo, 7,5 microlitri SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 &# 181; l di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione 29.
    6. Normalizzare l'espressione di specifici plasmide episomiale EBNA-1 gene utilizzando FBX-15 come le pulizie gene 29 (vedere i primer elencati nella tabella 1).
  6. Analisi del cariotipo
    1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni sulla piastra rivestita seminterrato matrice membrana senza alimentatore con uno spot definito, terreno di mantenimento senza alimentatore per iPSCs, seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Per avviare il protocollo di analisi cariotipo, staccare colonie IPSC con 1 ml di soluzione di distacco cellulare per 5 min a 37 ° C, fino ad ottenere la dissociazione singola cellula.
    3. Raccogliere cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Risospendere iPSCs in 2 ml di un mezzo appositamente sviluppato per coltura di cellule per le tecniche di diagnosi prenatale. IPSCs Piatto monocellulari sulla membrana basale matrici rivestite piatti di vetro e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> incubatrice.
    5. Dopo 2-4 giorni, aggiungere 10 microlitri / ml colchicina direttamente alle culture e incubare per 3 ore a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
    6. Aspirare il mezzo e incubare iPSCs in 1 ml di una soluzione ipotonica (0,6% di citrato di sodio e cloruro di potassio 0,13%) per 10 minuti a RT.
    7. Risciacquare le cellule con 1 ml di soluzione di acido acetico al 5% e fissare con iPSCs / soluzione metanolica di acido acetico (rapporto 3: 1) in una macchina con temperatura controllata e umidità (28 ° C, 42% UR).
    8. Immergere e le cellule macchia fissa con la soluzione Quinacrine per 15-20 minuti a temperatura ambiente al buio (per ottenere Q-banding) 30.
    9. Acquisire metafasi di cellule al microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X 29.

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Risultati

In questo studio un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs-virali libero da riprogrammazione della PBMNCs isolati da buffy coat congelati dopo centrifugazione del sangue intero e confronto con riprogrammazione della PBMNCs ottenute dopo la separazione gradiente di densità è riportato. La figura 1A mostra una rappresentazione schematica di il protocollo dettagliato. Dopo lo scongelamento, i PBMNCs isolato, mostrando una tipica forma arrotondata, vengono espanse in specifico terreno d...

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Discussione

In passato, l'unico modo per ottenere cellule staminali pluripotenti umane che trasportano una particolare mutazione genetica è stato quello di reclutare genitori sottoposti a diagnosi genetica pre-impianto e generare cellule staminali embrionali da loro blastocisti scartate 31,32. Utilizzando un approccio riprogrammazione, i ricercatori possono ora generare iPSCs di pazienti portatori di praticamente qualsiasi genotipo. La possibilità di partire da una linea cellulare paziente-specifica ed una fonte faci...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Lo studio è stato sostenuto dal Ministero della Salute e dal Dipartimento dell'Assistenza Educativa, Università e Ricerca della Provincia Autonoma di Bolzano e dalla Fondazione Sparkasse dell'Alto Adige.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Citrato di sodio tamponato Venosafe Tubo di plasticaTerumoVF-054SBCS07
Cloruro di ammodioSigma-AldrichA9434
Bicarbonato di potassioSigma-Aldrich60339
EDTA polvere disodicaSigma-AldrichE51340,5 M soluzione
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02Soluzione di polisaccarosio per centrifugazione
gradiente di densità Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) Gibco21056-023No fenolo rosso
prosciutto F-12Mediatech10-080-CV
insulina-transferrina-selenio-etanolammina (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Stock: 100X)
Concentrato lipidico chimicamente definitoGibco119050311X (Stock: 100X)
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9418
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idratoSigma-AldrichA8960
1-TioglicerinaSigma-AldrichM6145Concentrazione finale a 200 µ
M Fattore di cellule staminali umane ricombinanti (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (Stock:100 µ g/ml) 
Interleuchina-3 umana ricombinante (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stock: 10 µ g/ml)
Fattore di crescita insulino-simile umano ricombinante (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stock: 40 µ g/ml)
Eritropoietina umana ricombinante (EPO)R& Sistemi D 287-TC-5002 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Desametasone Sigma-AldrichD29151 μ M (A magazzino: 1 mM)
Olotransferrina umanaR& Sistemi D 2914-HT100 μ g/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco 11269016Terreno per analisi citogenetiche
mTeSR1StemCell Technologies5850Terreno per colture iPSC senza alimentatore
Knockout DMEMGibco10829-018
Knockout Siero sostitutivoGibco10828-028
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140-122
L-glutammina (200 mM)Gibco25030-024
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)Gibco11140-050
2-Mercaptoetanolo Gibco31350-0100.1 mM (Stock: 50 mM)
Butirrato di sodioSigma-AldrichB58870.25 mM (Stock: 0.5 m)
FGF umano ricombinante basico, 145 aa R& Sistemi D 4114-TC10 ng/ml (Stock: 10 µ g/ml)
Y-27632 dicloridratoSigma-AldrichY0503 10 µ M (Stock: 10 mM)
Siero bovino definito fetaleHycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0,1% Soluzione di gelatinaMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BDBiosciences354230
Collagenase, Tipo IVGibco17104-0191 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Soluzione di distacco cellulare
Fibroblasto embrionale di topo (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cells/6 pozzetti
piastra Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 µ g (Stock: 1 µ g/µ l)
Plasmide pCXLE-hSKAddgene 270781 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l)
Plasmide pCXLE-hULAddgene 270801 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l)
Plasmide pCXLE-EGFPAddgene 270821 & micro; g (Stock: 1 µ g/µ l)
Kit di colorazione della fosfatasi alcalinaStemgent00-0009
Anticorpo anti-antigene embrionale specifico per stadio-4 (SSEA-4)MAB43041/250
Anticorpo anti-TRA-1-60Merck-MilliporeMAB43601/250
Anticorpo anti-TRA-1-81 AnticorpoMerck-MilliporeMAB43811/250
Anticorpo Anti-Oct-3/4Santa Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anticorpo anti-nanogSanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anticorpo anti-troponina ISanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anticorpo anti-alfa-actinina (sarcomerico)Sigma-AldrichA77321/250
Classe neuronale III ß-Tubulina (TUJ1)Anticorpo Covance Prodotti di ricerca Inc MMS-435P-1001/500
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)Calbiochem657012 1/200
Alexa Fluor 488 Capra anti-topo Sonde molecolariA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Sonde molecolari anti-coniglio di capraA-214291/1000
Piastra per colture cellulari a bassissimo attaccamentoCorning3471
Reagente TrizolAmbion15596-018 reagente per l'estrazione dell'RNA
Kit di sintesi del cDNA SuperScript VILOInvitrogen11754050Kit di trascrittasi inversa
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 Sistema di rilevamento PCR in tempo realeBio-Rad185-5195
Experion Sistema di elettroforesi automatizzatoBio-Rad700-7000Strumento per verificare l'integrità dell'RNA
Experion RNA Kit di analisi HighsenseBio-Rad7007105Kit di reagenti per verificare l'integrità dell'RNA
Microscopio da dissezione (SteREO Discovery V12 )Zeiss495007
NeonSistema di trasfezione 100 &; l KitInvitrogenMPK10025Kit di reagenti per elettroporazione
Sistema di trasfezione al neonInvitrogenStrumento utilizzato per l'elettroporazione
Spettrofotometro UV/Vis NanoDropThermo ScientificND-2000Strumento per la quantificazione di DNA/RNA
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Kit di purificazione dei plasmidi
in MPK5000

Riferimenti

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