Viene presentato un protocollo per la generazione di vettori adenovirali ad alta capacità privi di tutte le sequenze di codifica virale. Il clonaggio dei transgeni contenuti nel genoma del vettore si basa sulle endonucleasi di homing. L'amplificazione del virus nelle cellule produttrici cresciute come cellule aderenti e in sospensione si basa su un virus helper che fornisce geni virali in trans.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vettori adenovirali ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali rappresentano uno dei vettori di consegna genica più avanzati grazie alla loro elevata capacità di confezionamento (fino a 35 kb), bassa immunogenicità e bassa tossicità. Tuttavia, per molti laboratori l'uso di HCAdV è ostacolato dalla complicata procedura per la costruzione del genoma del vettore e la produzione di virus. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per il clonaggio e la produzione efficiente di HCAdV basato sul plasmide pAdFTC contenente il genoma di HCAdV. La costruzione dei genomi di HCAdV si basa su un sistema di vettori di clonaggio che utilizza endonucleasi di homing (I-CeuI e PI-SceI). Qualsiasi gene di interesse fino a 14 kb può essere subclonato nel vettore shuttle pHM5, che contiene un sito di clonazione multiplo affiancato da I-CeuI e PI-SceI. Dopo il rilascio mediato da I-CeuI e PI-Scedel transgene dal vettore shuttle, il transgene può essere inserito nel vettore di clonazione HCAdV pAdFTC. A causa delle grandi dimensioni del plasmide pAdFTC e dei lunghi siti di riconoscimento degli enzimi utilizzati associati a un forte legame con il DNA, è necessaria un'attenta manipolazione dei frammenti di clonazione. Per la produzione di virus, il genoma HCAdV viene rilasciato dal digestato NotI e trasfettato in una linea cellulare produttrice basata su HEK293 che esprime stabilmente la Cre ricombinasi. Per fornire tutti i geni adenovirali per l'amplificazione dell'adenovirus, è necessaria la co-infezione con un virus helper contenente un segnale di impacchettamento fiancheggiato da siti loxP. La preamplificazione del vettore viene eseguita in cellule produttrici coltivate su superfici e l'amplificazione su larga scala del vettore viene condotta in fiasche rotanti con cellule produttrici coltivate in sospensione. Per la purificazione del virus, vengono eseguite due fasi di ultracentrifugazione basate su gradienti di cloruro di cesio seguite da dialisi. Qui vengono presentati suggerimenti, trucchi e scorciatoie sviluppati negli ultimi anni lavorando con questo sistema vettoriale HCAdV.
Introduzione
Per applicazioni terapeutiche gene è di grande importanza per evitare effetti collaterali citotossici e immunogenici causate da espressione di proteine virali, il transgene stesso o da proteine virali in arrivo. Adenovirus (adv) sono ampiamente utilizzati per introdurre DNA esogeno in un'ampia varietà di cellule per studiare l'impatto di espressione del transgene 1,2. La versione più avanzata di AdV è rappresentato da adenovirus ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali 3,4 e offrendo così una capacità di confezionamento fino a 35 kb in combinazione con bassa immunogenicità e bassa tossicità 5-8.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Costruzione di ricombinante HCAdV Genomi basato sul plasmide pAdFTC
Nota: Tutti i plasmidi sono stati descritti in precedenza 11,12 e sono disponibili su richiesta. La procedura di clonazione è schematicamente illustrato nella figura 1.
- Clonare un gene di interesse (GOI) inclusi il promotore e poliadenilazione segnale (pA) nella navetta plasmide pHM5, utilizzando una strategia di clonazione di scelta, per generare pHM5-GOI.
NOTA: Dal momento che pAdFTC è relativamente grande plasmide, sono raccomandati protocolli di preparazione plasmide classici per evitare sheering del DNA plasmide utiliz....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Sono mostrati esempi qui rappresentativi per la clonazione, l'amplificazione e la purificazione di preparati HCAdV. Una panoramica della strategia di clonazione (figura 1) ed esempi rappresentativi per la clonazione e il rilascio del genoma HCAdV da enzima di restrizione digerire sono forniti (Figura 2). Un modello di restrizione tipico dopo il rilascio della cassetta GOI-espressione da pHM5 da PI- Sce I e I-Ceu io digerisco e estra.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo presentato qui permette la purificazione di vettori HCAdV basati su adenovirus umano di tipo 5 basato su procedure descritte in precedenza 4,12. Il genoma HCAdV all'interno del plasmide pAdFTC è privo di tutti i geni di adenovirus e porta solo le 5'- e 3'ITR e il segnale di confezionamento. In questa strategia l'HV AdNG163R-2 4 offre tutti i geni necessari per la produzione di virus efficiente in trans. Questo offre una capacità di confezionamento di fino a 35.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione DFG EH 192/5-1 (A.E.), dal progetto UE (E-rare-2) Transposmart (A.E.), dall'UWH Forschungsförderung (E.S. e W.Z) e dal programma di dottorato dell'Università Witten/Herdecke (P.B.). J.L. è stato sostenuto da uno stipendio del consiglio cinese per le borse di studio e da T.B. e M.G dalla fondazione Else Kröner-Fresenius (EKFS).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CeuI | New England Biolabs | R0699S | restrizione digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restrizione digest |
| T4 Ligasi | New Engand Biolabs | M0202S | legatura SwaI |
| New England Biolabs | R0604S | restrizione digest | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restrizione digest |
| Fosfatasi alcalina intestinale di vitello (CIP) | New England Biolabs | M0290S | defosforilazione di plasmidi digeriti |
| Igromicina B | PAN Biotech | P02-015 | selezione di CRE che esprimono 116 cellule |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Terreno di coltura cellulare Hek293T |
| Terreno essenziale minimo (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 terreno di coltura cellulare |
| Dulbecco' s tampone fosfato soluzione salina (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | lavaggio delle cellule, risospensione delle cellule |
| flacone di conservazione da 250 ml | Sigma | CLS430281-24EA | infezione di 116 cellule coltivate in sospensione |
| 500 ml PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentazione di cellule da coltura |
| in sospensione Pallone di filatura | Bellco | 1965-61030 | crescita di 116 cellule in sospensione |
| Ultra Clear Provette per ultracentrifuga | Beckmann Coulter | 344059 | centrifugazione in gradiente di densità |
| Ultracentrifuga | Beckmann Coulter | centrifugazione in gradiente di densità | |
| SW-41 Rotore Beckmann | Coulter | centrifugazione in gradiente di densità | |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | tubi per dialisi |
| cassette per dialisi pronte all'uso | Thermo | 66383 | dialisi |
| one shot DH10B elettrocompetente E. coli | invitrogen | C4040-52 | trasformazione delle reazioni di legatura |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | di DNA |
| genomico SuperFect Transfection | Reagent Qiagen | 301305 | trasfezione di 116 cellule |
| opti MEM (10% FBS) | Gibco | 31985-062 | trasfezione di 116 cellule |
| iQ SYBR Green | Supermix BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Macchina Biorad | qPCR | |
| Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico | Carl Roth | A156.1 | purificazione del DNA |
| Cloruro di cesio | Carl Roth | 8627.1 | densità gradiente centrifugazione |
| acetato di sodio 99% | Carl Roth | 6773.2 | Precipitazione del DNA |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | etanolo medio di crescita batterica |
| puro al 99,8% | Carl Roth | 9065.5 | Precipitazione e lavaggio del DNA |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lisi tampone |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lisi tampone |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | tampone per dialisi/lisi tampone |
| glicerolo 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | tampone per dialisi |
| MgCl2 98.5% | Carl Roth | KK36.2 | tampone per dialisi |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | tampone per dialisi opzionale |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | tampone per dialisi opzionale |
| saccarosio | Carl Roth | 9286.1 | tampone per dialisi opzionale |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | tampone per dialisi opzionale |
| provette da 1,5 ml | Sarstedt | 72.730.005 | conservazione di preparati virali a -80 ° E |
Riferimenti
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
