La tecnica della cuffia accorcia e facilita il modello di trapianto eterotopico di cuore cervicale nei topi, evitando anastomosi di sutura tecnicamente impegnative di piccoli vasi. I dettagli tecnici mostrati in questo video paper dovrebbero consentire ai ricercatori di stabilire questo modello nei loro laboratori.
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Articolo metodologico
Eterotopico cervicale trapianto cardiaco nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto eterotopico di cuore cervicale nei topi è uno strumento prezioso nella ricerca sui trapianti e cardiovascolare. La tecnica della cuffia semplifica notevolmente questo modello evitando difficili anastomosi di sutura di piccoli vasi, riducendo così il tempo di ischemia calda. Rispetto all'impianto di innesto addominale, il modello cervicale è meno invasivo e l'innesto impiantato è facilmente accessibile per ulteriori esami di follow-up. Le anastomosi vengono eseguite tirando l'aorta ascendente dell'innesto sopra la cuffia con l'arteria carotide comune del ricevente e tirando l'arteria polmonare principale sopra la cuffia con la vena giugulare esterna. La selezione della dimensione appropriata del bracciale e la completa mobilizzazione dei vasi sono importanti per una rivascolarizzazione di successo. Il danno da ischemia-riperfusione (I/R) può essere ridotto al minimo perfondendo l'innesto con una soluzione cardioplegica e mediante ipotermia. In questo articolo, forniamo dettagli tecnici per una tecnica di cuffia semplificata e migliorata, che dovrebbe consentire ai chirurghi con competenze microchirurgiche di base di eseguire la procedura con un alto tasso di successo.
Introduzione
Il modello di trapianto di cuore è spesso utilizzato per studiare / R-infortunio io, rigetto post-trapianto vasculopatia e l'efficienza degli agenti immunomodulatori. Modelli murini uniscono numerosi vantaggi come la immunologico noto e background genetico, la disponibilità di molti ceppi inbred e transgenici e relativamente bassi costi sperimentali.
Nel 1973, una tecnica di trapianto di cuore addominale nei topi è stato descritto da Corry et al 1. In questo modello innesti vengono rivascolarizzati entro end-to-side anastomosi dell'aorta ascendente alla aorta addominale del destinatario e della principale arteria polmonare per la vena cava inferiore. Nel 1991, una tecnica di sutura per il trapianto di cuore cervicale nei topi è stato descritto da Chen ed altri 2. In questo modello un retrogrado perfusione coronarica è stabilito da anastomosi della carotide del destinatario per l'aorta ascendente del grpoppa. Gli scarichi sangue venoso attraverso il seno coronarico nell'atrio destro, il ventricolo destro e viene espulso attraverso l'arteria polmonare nel ricevente vena giugulare esterna (Figura 1). In confronto al trapianto di impianto addominale il modello cervicale è meno invasiva e la posizione superficiale del trapianto permette un'accessibilità molto facile per gli esami di follow-up aggiuntivi (ad esempio, la palpazione, l'ecocardiografia, la microscopia a fluorescenza intravitale) 3,4.
Nonostante i miglioramenti tecnici 5,6, un uso più diffuso di questo modello è stato limitato a causa di difficoltà tecniche per eseguire anastomosi suturati dei piccoli vasi con un elevata incidenza delle perdite anastomosi e trombosi. Nel 1991, Matsuura et al. introdotto la tecnica bracciale in cui la parete del vaso è estroflesso su un cilindro sintetico, che facilita notevolmente il modello di trapianto di cuore cervicale 7. La tecnica era Further adottato per vari modelli sperimentali di trapianto renale, tra cui 8, 9 del pancreas, degli arti 10, epatica 11,12, 13,14 e trapianto polmonare vascolare 15. Rispetto alla tecnica di sutura il tempo richiesto per anastomosi e, quindi, il tempo di ischemia calda è più breve e ci sono complicazioni vascolari significativamente meno con la tecnica bracciale 16. Inoltre, esso consente al chirurgo con formazione minima in microchirurgia per eseguire l'operazione con un alto tasso di successo. Uno svantaggio di questa tecnica è il bracciale legatura prerequisito della carotide comune, che possono alterare la perfusione cerebrale.
In questo articolo il video vi presentiamo una tecnica bracciale migliorato e semplificato per il trapianto di cuore cervicale nei topi.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal tedesco Heart Center di Monaco di Baviera e il governo della Baviera, Germania (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Gli animali sono stati alloggiati in una specifica struttura gratuito patogeno e hanno ricevuto assistenza umana in conformità ai "Principi di laboratorio cura degli animali" formulate dalla Società Nazionale per la ricerca medica e la "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" fornita dalla National Academy di Scienze e pubblicato dal National Institutes of Health (NIH pubblicazione n. 86-23, rivisto 1985).
NOTA: Un set completo di strumenti di microchirurgia sterili, tra cui due pinze curve e dilatatori nave, è necessario per la procedura (Figura 2a). La profilassi antibiotica perioperatoria non è di routine necessario ma può essere indicato in animali immunocompromessi. Gli animali sono stati sacrificati con il morsetto inalazione isoflurano.
Donatori Preparazione e Graft Harvest
- Anestetizzare l'animale intraperitoneale (ip) iniezione di midazolam (5,0 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) e fentanyl (0,05 mg / kg di peso corporeo). Posizionare il mouse in posizione supina sul campo operatorio e confermare la tolleranza chirurgica dal riflesso recesso pedale.
- Disinfettare la pelle tre volte con clorexidina e di eseguire una incisione addominale mediana. Ritrarre l'intestino con garza umida verso sinistra per esporre la vena cava inferiore.
- Iniettare 50 UI di eparina diluito in 0,4 ml di soluzione salina attraverso la vena cava inferiore per anticoagulante. Incidere la nave 1 min dopo eparinizzazione.
- Aprire il diaframma ed eseguire una toracotomia bilaterale per esporre il cuore. La parete toracica anteriore si riflette superiormente e tenuta in posizione con una fascetta.
- Rimuovere il timo e senza mezzi termini sezionare il tessuto connettivo tra aorta e tronco polmonare. Incidere la giusta vena cava superiore.
- Forare il aorta ascendente mobilitato a livello dellatronco brachiocefalico con un ago da 30 G montato su una siringa da 5 ml e lentamente defluire in cuore retrogradually senza pressione eccessiva con 3 ml di 4 ° C la soluzione cardioplegica fredda. Evitare l'ingresso di aria in circolo coronarico. Goccia soluzione salina ghiacciata sul trapianto per migliorare ulteriormente l'arresto cardiaco.
- Transect l'aorta prossimalmente all'origine del tronco brachiocefalico.
- Legare il cavae inferiore ed entrambi Venae superiore vicino al cuore con 8-0 seta e transetto loro distalmente alle legature.
- Sezionare gratis il tronco polmonare distale possibile. Legare le arterie polmonari vicino alla biforcazione con 8-0 seta e transetto li distale.
- Legare le vene polmonari tutti insieme con un unico legatura 8-0 seta e transetto.
- Rimuovere il cuore del donatore e conservarla in soluzione cardioplegica ghiacciata fino impianto.
2. Destinatario Preparazione
- Prepararepolsini per anastomosi tagliando il tubo poliimmide con un bisturi No. 11 o una forbice sotto il microscopio. Il bracciale è costituito da un corpo cilindrico ed una estensione (1/3 della circonferenza) per il posizionamento della pinza vascolare, ciascuna di una lunghezza di 1 mm (Figura 2b).
- Anestetizzare l'animale e confermare la tolleranza chirurgica come descritto sopra. Iniettare 0,25 ml di soluzione salina calda per via sottocutanea (sc) per la sostituzione del fluido.
- Rimuovere i capelli della regione cervicale destra con un rasoio elettrico e posto l'animale in posizione supina su un tappetino caldo. Fissare le gambe con fili di nastro adesivo, evitando pressioni eccessive gli arti anteriori come questo può compromettere la respirazione. Coprire gli occhi con pomata oftalmica per prevenire la secchezza. Disinfettare il sito chirurgico tre volte con clorexidina.
- Fare un incisione cutanea trasversale dall'angolo mandibolare diritto alla tacca giugulare.
- Senza mezzi termini mobilitare il external vena giugulare. Cauterize rami laterali con una pinza bipolare e transetto.
- Dividere la vena giugulare esterna tra legature a livello della confluenza con la vena dalla ghiandola sottomandibolare.
- Estrarre la vena giugulare esterna attraverso il bracciale e occludere il vaso prossimalmente posizionando un morsetto vascolare sull'estensione del bracciale. Togliere la legatura ed irrigare il lume del vaso con soluzione salina eparinizzata 01:10.
- Evert la parete del vaso sopra il bracciale e fissarlo con un preset circonferenziale 8-0 legatura di seta.
- Togliere la parte superficiale del muscolo sternocleidomastoideo.
- Mobilitare il diritto carotide comune e transetto della nave tra le legature di sotto della biforcazione carotidea.
- Estrarre carotide attraverso il bracciale e occludere il vaso prossimalmente posizionando un morsetto Yasargil sull'estensione del bracciale. Togliere la legatura ed irrigare il lume del vaso con soluzione salina eparinizzata 01:10.
- Delicatamente Dilate il lume arterioso con un dilatatore vaso, Evert la parete del vaso sopra il bracciale e risolvere il problema con un preset circonferenziale 8-0 legatura di seta.
- Per guadagnare spazio sufficiente per innesto impianto, rimuovere il lobo destro della ghiandola sottomandibolare.
- Mantenere il campo operatorio umido finché l'impianto.
3. Graft impianto
- Posizionare l'innesto nella regione cervicale destinatario testa in giù con l'aorta orientato medialmente e l'arteria polmonare lateralmente.
- Estrarre l'aorta dell'innesto sul bracciale con la carotide e fissare la anastomosi con una legatura circonferenziale 8-0 seta.
- Incidere il tronco polmonare sul suo aspetto anteriore e tirarlo sopra il bracciale con la vena giugulare esterna. Anche in questo caso garantire l'anastomosi con una legatura circonferenziale 8-0 seta.
- Rimuovere la fascetta sulla vena giugulare esterna, seguendo dal sbloccaggio della carotide. I cuori riempie immediatamente con il sangue. Per migliorare reperfusion goccia 37 ° C soluzione salina calda sul trapianto. Normalmente il cuore si sviluppa ritmo sinusale entro un minuto. Rimuovere l'estensione bracciale al sito venoso.
- Garantire la posizione dell'innesto corretta, anastomosi devono essere privi di tensione e di navi senza torsione. Non vasi cauterizzata della pelle in quanto ciò può compromettere la guarigione della ferita. Il sanguinamento di solito si arresta spontaneamente. Chiudere la pelle con un solo 8-0 continuo di sutura.
4. Cura postoperatoria
- Iniettare 0,25 ml soluzione salina calda sc per la sostituzione del fluido.
- Inimicarsi narcotici iniettare naloxone (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg di peso corporeo) sc sinistra l'animale sul pad caldo fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Osservare l'animale per almeno un'ora aggiuntiva di registrare un comportamento anomalo. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino al completo Recoverosso.
- Fornire preemptive analgesia con buprenorfina (0,05 mg / kg sc tre volte al giorno) o un'analgesia alternativa secondo un protocollo istituzionale locale per una durata minima di 72 ore dopo la procedura.
- Il chirurgo e un veterinario dovrebbe vedere regolarmente animali. In caso di perdita di peso> 15%, apatia, gonfiore o chirurgiche animali di infezione lato sono eutanasia con il morsetto inalazione isoflurano.
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Risultati
La nostra squadra ha potuto svolgere con successo la tecnica descritta dopo circa 20 interventi chirurgici di formazione. La parte più difficile è per rovesciare la parete del vaso della carotide sul bracciale, perché gira facilmente avanti e tentativi multipli può portare alla lacerazione della parete. Dopo il periodo di formazione, il tempo operatorio totale media era di 60 ± 8 min. Circa 20 minuti sono necessari per la raccolta dei donatori, 25 minuti per la preparazione dei vasi cervicali e 15 minuti per anastomosi ...
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Discussione
Abbiamo completato oltre 200 trapianti cardiaci con una percentuale di successo superiore al 90% in diversi contesti sperimentali. Con la tecnica qui descritta, la procedura completa può essere eseguita entro 60 minuti da un chirurgo esperto. Preparando i vasi cervicali prima reperimento di organi, il tempo totale ischemia innesto può essere limitata a 20 min. Tempo per l'impianto (tempo di ischemia calda) è molto più breve con la tecnica gambetto rispetto alla tecnica di sutura 16.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
M.-A. Deutsch è supportato da Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014) Deutsche Stiftung für Herzforschung e Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane è supportato da Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herz Kreislauf Forschung (DZHK B 13-050A; DZHK B 14-013SE) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1; KR3770/9-1)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinza JFC-7.2 | S& T | P-00036 | Punta curva 0,20 mm |
| Dilatatore per vasi D-5a | S& T | S-00124 | |
| Forbice Adventita | S & T | S-00102 | |
| Morsetto vascolare B-1V | S& T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65.097 | 3,5 mm di lunghezza |
| Pinze bipolari | Micromed | 148-100-011 | punta 0,25 mm |
| Tubi in poliimmide | River Tech Medical | 19-24 calibro | |
| 8,0 legature di seta | Catgut | ||
| Custodiol HTK soluzione | Essential Pharmaceuticals |
Riferimenti
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
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