Questo protocollo descrive l'efficiente induzione dell'endotelio emogenico e dei progenitori ematopoietici multipotenziali da cellule staminali pluripotenti umane attraverso l'espressione forzata di fattori di trascrizione.
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Articolo metodologico
Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l'induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l'osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.
Introduzione
La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale 1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoie....
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Protocollo
1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni
- Preparare soluzioni con PSIN-EF1α lentivirale plasmide di espressione contenente proteine DNA codificante per ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 e LMO2 (Tabella 1).
- Misurare la concentrazione e la purezza dei preparati plasmide usato per la produzione lentivirale registrando assorbimento UV con uno spettrofotometro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: Preparati DNA dimostrano A260 / 280 e A260 / 230 valori superiori a 1.8 sono generalmente considerati di buona qualità. Lower A260 / 280 valori possono indicare contaminazione di proteine, mentre bassi valori A260 / 230 indicano....
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Risultati
Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo sta.......
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Discussione
Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti 10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 non.......
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Dichiarazioni
IS è socio fondatore e consulente per Cynata.
Ringraziamenti
Ringraziamo Matt Raymond per l'assistenza editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi del National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 e P51 RR000167) e della Charlotte Geyer Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
Table 1. Induzione della differenziazione delle hPSC con fattori di trascrizione e analisi dell'endotelio emogenico e delle cellule del sangue. | |||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmide #61061 | Vettore lentivirale |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmide #61063 | Vettore lentivirale |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmide #61062 | Vettore lentivirale |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmide #61062 | Vettore lentivirale |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmide #61064 | Vettore lentivirale |
| Esadimetrina bromuro (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Polimero cationico utilizzato per aumentare l'efficienza dell'infezione |
| Y-27632 (dicloridrato) Inibitore di ROCK | STEMCELL Technologies | 72302 | Inibitore della via RHO/ROCK Inibisce ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Reagente |
| Terreno di coltura incompleto (privo di fattore di crescita) mTeSR1 Formulazione personalizzata | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Terreno mTeSR1 senza siero senza bFGF e TGFb |
| umano SCF | Peprotech | 300-07 | |
| TPO umano | Peprotech | 300-18 | |
| FGF umano di grado | Peprotech | 100-18B | |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Marcatore endoteliale (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Ematopoietico ( FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Ematopoietico (FACS) |
| CD73 APC | R& Sistemi D | FAB5795A | marcatore endoteliale (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Fissazione cellulare |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilizzazione |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Siero fetale bovino |
| Mouse anti-umano CD43 | BD Biosciences | 551457 | Anticorpo primario puro per la colorazione in immunofluorescenza (IF) Coniglio |
| anti-umano VE-caderina | BenderMedSystem | BMS158 | Primario (IF) |
| Anti-coniglio Alexa Fluor 488-coniugato | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondario (IF) |
| Anti-topo Alexa Fluor 594-coniugato | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondario (IF) |
| Colorazione con acido nucleico DAPI | Life Technologies | D1306 | Saggio vivo/morto (IF) |
| Terreno clonogenico MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | Saggio CFC |
| Soluzione di colorazione di Wright | Sigma -Aldrich | 32857 | Colorazione di citospin< |
Table 2. hPSCs culture. | |||
| Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) cellule staminali embrionali umane; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) cellule staminali pluripotenti indotte senza transgeni | hPSCs hPSCs sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre strati germinali |
| Terreno completo privo di siero per la coltura di hPSCs mTeSR1 media | Istituto di ricerca WiCell (Madison, WI) | M500 | Terreno privo di siero con fattori di crescita per colture prive di feeder di ESC/iPSC |
| Matrigel | BD Bioscienze / Corning | 356234 | Matrice per il mantenimento di ESC / iPSC umane |
| DMEM / F-12, polvere | Life Technologies | 12500-062 | Mezzo basale |
| HyClone Dulbecco's PBS polvere | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, polvere | Life Technologies | 17105-041 | Proteasi neutra, dissociazione cellulare |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. | |||
| Nome del primer | Forward (Fwd) 5' -->3' | Reverse (Rev) 5'-->3' | Descrizione |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a sequenza promotore |
| GATA1 Rev | - | -TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Regione di codifica |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Regione di codifica |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Regione di codifica |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Regione di codifica |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Regione di codifica |
Riferimenti
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mo....
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Ristampe e permessi
