Protocolli per Robust erbicidi Test della resistenza in diversi Weed Specie

Sommario

Viene presentato un approccio robusto e flessibile per confermare la resistenza agli erbicidi nelle popolazioni di erbe infestanti. Questo protocollo consente di dedurre i livelli di resistenza agli erbicidi e di applicarli a un'ampia gamma di specie di erbe infestanti ed erbicidi con adattamenti minori.

Abstract

Protocolli robusti per testare popolazioni di infestanti resistenti agli erbicidi putativi a livello di intera pianta sono essenziali per confermare lo stato di resistenza. I protocolli presentati, basati su biotest su piante intere eseguite in serra, possono essere facilmente adattati a un'ampia gamma di specie di erbe infestanti ed erbicidi attraverso opportune varianti. I campioni di semi di piante sopravvissute a un trattamento con erbicidi sul campo vengono raccolti e conservati all'asciutto a bassa temperatura fino al momento dell'utilizzo. I metodi di germinazione differiscono a seconda delle specie infestanti e del tipo di dormienza dei semi. Le piantine in una fase di crescita simile vengono trapiantate e mantenute in serra in condizioni adeguate fino a quando le piante non hanno raggiunto la giusta fase di crescita per il trattamento con erbicidi. È necessaria l'accuratezza per preparare la soluzione erbicida per evitare errori non verificabili. Vengono valutati anche altri passaggi critici come il volume di applicazione e la velocità di spruzzatura. I vantaggi di questo protocollo, rispetto ad altri basati su biotest di intere piante che utilizzano una dose di erbicida, sono legati alla maggiore affidabilità e alla possibilità di dedurre il livello di resistenza. Sono stati proposti test di screening diagnostico in vivo o in vitro più rapidi e meno costosi (biosaggi su piastra di Petri, test spettrofotometrici), ma forniscono solo informazioni qualitative e il loro uso diffuso è ostacolato dal laborioso set-up che alcune specie possono richiedere. Per i test di resistenza di routine, il biodosaggio dell'intera pianta proposto può essere applicato con una sola dose di erbicida, riducendo così i costi.

Introduzione

Gli erbicidi sono la misura diserbo più ampiamente utilizzato, che rappresentano fino al 50% del mercato globale fitosanitari ^1. Si tratta di strumenti relativamente a buon mercato, di evitare di suolo pratiche di coltivazione e di tempo ad alta intensità di manodopera, e concludersi con la produzione di costo-efficace, sicuro e redditizio cibo ^2. Tuttavia, la grande variabilità genetica fenologica e presente in molte specie infestanti, insieme con un eccessivo affidamento sulla erbicidi, spesso si traduce nella selezione delle popolazioni infestanti resistenti agli erbicidi. L'introduzione di erbicidi selettivi con una specifica destinazione metabolica ^3-5 è notevolmente aumentato il numero di casi di resistenza nel tempo. Ad oggi, 240 specie di piante infestanti dicotiledoni (140 e 100) in tutto il mondo monocotiledoni sono evoluti resistenza a diversi siti erbicidi di Azione (SOA) ^4. Questa è una grande preoccupazione per la gestione delle infestanti e più in generale per la produzione agricola sostenibile.

e_content "> La diagnosi precoce della resistenza, basata su prove attendibili, spesso eseguiti in una serra, è un passo fondamentale per gestire le erbe infestanti resistenti agli erbicidi. Diversi approcci sono stati sviluppati secondo le finalità, richiesto livello di precisione, il tempo e le risorse disponibili, come nonché le specie infestanti considerate ^6-12. Tuttavia, quando è richiesta la conferma dello stato di resistenza di un nuovo biotipo infestanti (cioè, un gruppo di individui che condividono alcune caratteristiche fisiologiche, inclusa la capacità di sopravvivere uno o più erbicidi appartenenti ad un particolare gruppo utilizzato in una dose che normalmente li controllo), un robusto tutta saggio biologico impianto deve essere eseguita in un ambiente controllato ^{4, 11.}

Un biotipo è raramente resistente a un solo erbicida. Ogni biotipo è quindi caratterizzato da un certo profilo di resistenza, cioè, il numero e il tipo di SoA degli erbicidi è resistente, e da una determinata resistenzalivello per ogni erbicidi ^13. La determinazione precoce e affidabile del modello di croce o resistenza multipla ^{5, 14} è importante per la gestione della resistenza di campo.

Vale la pena ricordare che la resistenza agli erbicidi non ha nulla a che fare con la tolleranza naturale che alcuni presentano erbaccia specie nei confronti di alcuni erbicidi, per esempio, dicot specie contro erbicidi ACCase-inibitori, specie monocot vs 2,4-D, equiseto arvense vs. glifosato.

Questo articolo presenta un approccio robusto per testare biotipi resistenti agli erbicidi putativo campionati in campi in cui era stato segnalato uno scarso controllo da erbicidi (s). Varianti rilevanti ai protocolli standard in relazione alle specie infestanti coinvolti sono presentati. I vantaggi rispetto alternativi tecniche / protocolli basati su entrambi interi biosaggi vegetali utilizzando soltanto una dose erbicida ^15, o semi trattamento in piastre Petri ⁸ sono legati alla maggiore reliability e la possibilità di ricavare il livello di resistenza a causa dell'inclusione di due dosi erbicidi negli esperimenti. Tuttavia, per la prova di resistenza di routine, gli stessi metodi possono essere applicati a una sola dose erbicida, così riducendo i costi.

Oltre a permettere conferma dello status di resistenza, le informazioni ottenute possono essere utilizzate sia per ottimizzare le seguenti operazioni di ricerca e / o elaborare strategie di gestione della resistenza sonori.

Protocollo

1. Seed Campionamento e conservazione

1. Monitorare campi coltivati ​​per ingiustificato scarse prestazioni erbicida, cioè non a causa delle condizioni climatiche avverse o per trattamenti erbicidi di bassa qualità.
2. Raccogliere un campione di seme da una specie alla volta e assegnare un codice univoco. Semi maturi sono di solito raccolti prima coltivazione raccolta da piante che erano sopravvissute al trattamento erbicida (s). Monitor tempestiva per osservare se i semi sono capannone da pianta madre a maturità.
3. Compilare un modulo per ogni campione che indica il codice univoco assegnato, il nome della specie, la data di raccolta, coordinate GPS, comune, il nome del contadino, dimensioni del campo, il livello di infestazione, ritagliare, erbicidi (s), utilizzati durante la stagione e documenti storici del settore .
4. Raccogliere semi da almeno 30 piante selezionate casualmente rappresentativi di infestazione campo. Assicurarsi che il campione seme contiene almeno 5.000 semi maturi. Per un obbligati out-cross specie infestanti(Ad esempio, Lolium spp. O Amaranthus spp.), Ridurre il numero di piante per 10-15, mantenendo il numero totale di semi circa 5.000 ^11.
5. Sottocampione il campo se le patch di erbacce sono sparsi su aree di grandi dimensioni (più di un ettaro) sono selezionati come diversi biotipi resistenti agli erbicidi.
6. Conservare i semi in sacchetti di carta non sigillati etichettati con il codice univoco assegnato.
7. Lasciar evaporare l'umidità, ma non esporre i semi ad alte temperature (ad esempio, evitare di lasciare in una macchina sotto il sole) o alle fluttuazioni di temperatura estreme per evitare l'induzione di dormienza secondaria.
8. Clean (rimuovere chaff, semi de-scafo, etc.) e conservarli a temperatura ambiente in un luogo asciutto. Dopo aver condotto il primo test di resistenza, memorizzare i semi per lunghi periodi di tempo in una stanza buia a 4 ° C, preferibilmente in sacchetti di plastica sottovuoto. In questo modo i semi di preservare la loro vitalità per un tempo significativamente più lungo.

2. Seed Dormienza Rompere

NOTA: Seed dormienza fornisce un meccanismo flessibile ed efficiente che permette di adattare le erbacce e persistere in ecosistemi agricoli. Per rompere dormienza e consentire la germinazione dei semi, differenti protocolli devono essere utilizzati a seconda delle specie infestanti, cioè il tipo di dormienza ^16.
Ci sono tre modi principali per rimuovere dormienza:

1. Vernalizzazione
   NOTA: Per ottenere la germinazione simultanea e l'emergenza delle piantine, un periodo di vernalizzazione seme che vanno da pochi giorni a una settimana è necessario rimuovere la dormienza fisiologica di molte specie: ad esempio., Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, persicaria Polygonum , Falaride paradoxa ^17-19. È richiesto un periodo fino a 15 giorni in più per rhoeas, difformis Cyperus e Ammania coccinea e fino a 30 giorni per Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Metti un po 'di acqua deionizzata in piatti di plastica. Tagliate due strati di carta da filtro e ammollo in acqua, rimuovere l'eccesso. Mettere i semi essiccati sulla carta. Trasferire le piastre di plastica per un frigorifero a 4 ° C per il periodo di tempo richiesto.
2. Scarificazione
   NOTA: Alcune specie infestanti sono più recalcitranti alla germinazione di altri a causa di dormienza meccaniche, vale a dire le caratteristiche tegumento, e richiedono l'uso di una scarificazione chimica con acido solforico al ²¹ germinare.
   1. Preparare un bicchiere con acido solforico concentrato (95-98%). Preparare un bicchiere pieno d'acqua. Mettete i semi in una busta di tessuto non tessuto.
   2. Immergere esempio, Echinochloa spp. O sorgo semi halepense per 20 min o 5 min, rispettivamente in acido solforico concentrato.
   3. Prendere la busta fuori del bicchiere con un paio di pinzette e metterlo nel bicchiere pieno d'acqua. Apri ilbusta, mettere i semi in un piccolo colino e sciacquare abbondantemente con acqua corrente.
   Variante: A. plantago-aquatica ha bisogno di un diverso protocollo ^{22, 23}
   1. Mettere a bagno i semi per 2 minuti in cloroformio. Risciacquare con acqua deionizzata i semi e asciugarle con carta assorbente. Dunk la semi in 80% di acido solforico per 5 min.
   2. Mettete i semi in un piccolo colino e sciacquare accuratamente sotto acqua corrente.
3. Post-raccolta maturazione del seme
   NOTA: I semi di altre specie infestanti non germinano affatto per alcuni mesi dopo la maturità, a prescindere dal metodo utilizzato per rompere dormienza.
   1. Conservare i semi per un periodo di almeno 3-4 mesi a temperatura ambiente e bassa umidità e quindi seguire i protocolli di cui sopra per dormienza rottura (ad esempio, Oryza sativa var. Sylvatica o P. rhoeas).

3. Seed Germinazione

1. Semi posto per essere germinated in plaspiatti tic contenenti 0,6% (m / v) di agar con nitrato di potassio 0,1% (KNO ₃₎ ha aggiunto:
   1. Preparare una soluzione di agar allo 0,6% + 0.1% KNO ₃ con acqua deionizzata. Sciogliere l'agar in un forno a microonde.
   2. Versare la soluzione di agar in piatti di plastica. Raffreddare il substrato e poi mettere nei semi.
   Variante: suolo può anche essere usato come substrato in piatti di plastica. Questa pratica è particolarmente efficace per Echinochloa spp., S. halepense e Lolium spp.
2. Inserire piatti di plastica in un armadio di germinazione per circa una settimana con condizioni di luce e temperatura a seconda delle condizioni ottimali per ogni specie infestanti. Per la maggior parte delle specie d'inverno, l'escursione termica è 15/25 ° C la notte / giorno e 12 ore fotoperiodo con tubi al neon che forniscono una densità fotosintetica Photon Flux (PPFD) del 15-30 mmol ^m-2 sec ^-1. Per molte specie estive, l'intervallo di temperatura è 15/30 ° C notte / giorno.
   Variante: Some specie, come S. halepense, hanno bisogno di un trattamento termico. Pertanto dopo la scarificazione, semi di S. halepense sono sottoposti alle seguenti condizioni: cicli di 4 ore a 45 ° C e 20 ore a 24 ° C per tre giorni nell'armadietto germinazione, e successivamente tre giorni in condizioni normali.

4. piantina trapianto e crescita

1. Trapianto quindici-venti piantine in vassoi di plastica (325 x 265 x 95 mm) riempito con una miscela standard di invasatura (60% del suolo argilloso limosa, il 15% di sabbia, il 15% e il 10% agriperlite di torba - in volume).
   NOTA: Trapianto, invece di semina diretta, permette un supporto uniforme piante nella stessa fase di crescita da ottenere, che è un importante prerequisito per ottimizzare le prestazioni del trattamento erbicida.
2. Identificare ogni vassoio con un codice a barre comprese tutte le informazioni per l'identificazione univoca: codice popolazione, diserbanti in fase di test, replicare il numero e il numero progressivo del vassoio <./ Li>
3. Luogo vassoi in una serra e piante acquatiche riscaldate come necessario per mantenere il substrato in prossimità o capacità di campo.
   NOTA: la temperatura di crescita varia a seconda delle specie infestanti. Spesso i test vengono effettuati durante l'autunno / inverno / primavera, quindi la luce è integrata con 400 W lampade a ioduri metallici, che forniscono una PPFD di circa 150 mmol ^m-2 sec ^-1 ed un fotoperiodo 12 ore ^24, specie ^19. Erbaccia estate con C ₄ ciclo fotosintetico di solito richiedono maggiore intensità luminosa e, pertanto, le prove sono fatte in primavera-estate in ritardo o l'intensità della luce integrata è di circa 400 mmol ^m-2 sec ^-1 con un fotoperiodo 14 hr.
4. Utilizzare un protocollo diverso per alcune specie infestanti infestanti risone, ad esempio, A. plantago-aquatica, S. mucronatus e C. difformis come descritto in ^22.
   1. Trapianti le piantine in vassoi di polistirolo con 24 cellule rotonde (55 mm di diametro, 64 mm di profondità) Filled con 60% terreno argilloso limoso, 30% sabbia e 10% di torba (in volume).
   2. Impostare i vassoi nei formati 12 cm contenitori di plastica profonde riempite con acqua e battened giù da tondini in acciaio inox avvitate per impedire loro galleggiante (Figura 1).
   3. Mantenere il livello dell'acqua in contenitori a 1-2 cm sotto il livello della superficie del suolo e aggiungere 1,5 g di solfato di rame per ogni contenitore (che contiene 10-12 L di acqua) per evitare il proliferare di alghe.

5. trattamenti erbicidi

1. I trattamenti con erbicidi pre-emergenza:
   1. Dopo circa tre giorni nel gabinetto di germinazione, come descritto nella sezione 3, trapiantare i semi germinano in vassoi di plastica contenenti il ​​substrato sopra descritto e coprire con uno strato di terreno (circa 1 cm). Questa è una fase critica per garantire che le piantine non emergeranno per effetto erbicida piuttosto che una profondità di seppellimento eccessivo.
   2. Prendete il substrato campo capacittà collocando i vassoi, che hanno alcuni fori sul fondo, su piattini pieni d'acqua.
   3. Un giorno dopo il trapianto, trattare i vassoi con l'erbicida di pre-emergenza ^25.
   4. Mantenere il substrato o la capacità campo vicino aggiungendo acqua se necessario sia dall'alto e dal basso per capillarità dal piattino. Questa procedura favorisce la permanenza dell'erbicida alla profondità corretta (cioè dove i semi germinano sono) per una buona efficacia del trattamento.
2. I trattamenti con erbicidi post-emergenza:
   1. Spruzzi le piante quando raggiungono lo stadio di 2-3 foglie (cioè, la fase di crescita del 12-13 Extended scala crescita BBCH ^26).
   2. A partire dal giorno dopo il trattamento, impostare il sistema di irrigazione secondo le esigenze idriche di specie infestanti e la stagione (ad esempio, per Echinochloa spp. Eroga acqua per 3 min 4 volte al giorno, ad intervalli regolari dalle 9 alle 9 pm). L'acqua è discontribuito con un sistema automatico di irrigazione a pioggia.
      Variante: glifosato è applicato nello stabilimento fase BBCH 14-21.
3. Preparazione erbicidi e la distribuzione.
   NOTA: Tutte le erbicidi (pre e post-emergenza) sono quelle in vigore formulazioni commerciali con tensioattivi raccomandate a due dosi, la dose raccomandata di campo (1x) e tre volte quella (3x).
   1. Se necessario, preparare la soluzione tensioattivo di rinfuse secondo le istruzioni riportate sull'etichetta; la concentrazione finale è generalmente espresso come percentuale del volume finale (ad esempio, 0,3%) o il volume da distribuire per unità di superficie (ad esempio, 1 L ha ^-1).
   2. Utilizzare la soluzione tensioattivo come solvente per la soluzione erbicidi (soluto) al fine di mantenere la corretta concentrazione del principio attivo. Preparare la soluzione erbicida più concentrata prima (3x). Calcolare la quantità di prodotto commerciale da disciogliere nella soluzione tensioattivo (o in acqua deionizzata se untensioattivo non è necessario) mediante la seguente equazione:
      Dose _erba = [(Dose _campo x Dose _max) x V _def] / V _del
      Dove: Dose _erba = dose di erbicida (ml), Dose Dose _campo = campo erbicida (ml ha ^-1), Dose _max = massima dose erogata, V _fin = volume finale della soluzione (L), V = _del volume erogato dalla panchina spruzzatore (L ha ^-1).
   3. Diluire (2: 1, v / v) l'erbicida soluzione 3x preparare quella meno concentrata (1x). Questa procedura riduce la possibilità di commettere errori nel valutare o pipettaggio erbicidi. Concentrazione della soluzione Erbicida è espressa come il volume da distribuire per unità di superficie (L ha ^-1).
   4. Avviare la sequenza di trattamento con la dose più bassa erbicidi (1x). In questo modo non è necessario lavare l'armadietto di spruzzatura tra due trattamenti con lo stesso erbicida.
   5. Distribuire il solutio erbicidin utilizzando uno spruzzatore panchina precisione erogare 300 L ha ^-1 (± 1%), ad una pressione di 215 kPa, e una velocità di 0,75 m sec ^-1, con un braccio dotato di tre piatti-ventilatore (range esteso) ugelli idraulici .
   6. Lavare due volte il mobile a spruzzo quando l'erbicida viene modificato con candeggina 1% (v / v) e poi risciacquare.
      Variante: glifosato è applicata con un volume di spruzzo di 200 L ha ^{-1 27.}
      NOTA: Una particolare attenzione deve essere pagato quando diserbanti altamente biologico, tale il sulfometuron sulfaniluree o flazasulfuron, vengono utilizzati. In quest'ultimo caso effettuare una lavaggio con una soluzione di candeggina e un altro con ammoniaca (2,5% v / v), seguita da un risciacquo accurato con acqua.

6. Raccolta e analisi dei dati

1. Attraverso un lettore di codice a barre, che identifica automaticamente ogni vassoio, registrare il numero di piante che sono sopravvissuti al trattamento, nonché la biomassa stimato Visuale (VEB). Le piante sono culonon elaborato come essere morto se non mostrano crescita attiva a prescindere dal colore o l'altro aspetto.
   1. Effettuare la valutazione di tre o quattro settimane dopo il trattamento (WAT) a seconda delle erbicidi provati (per es, tre WAT inibitori ACCase e quattro WAT per SLA inibitori o glifosato).
   2. Valutare l'efficacia generale trattamento includendo una popolazione suscettibile (check S) in tutti gli esperimenti, cioè, una popolazione raccolti in un sito che è stato mai o raramente trattati con erbicidi.
   3. La sopravvivenza delle piante espresso come percentuale del numero di piante trattate, contato poco prima del trattamento erbicida, e calcolare l'errore standard (SE) per il valore medio (valore delle due repliche media).
   4. Il VEB è ottenuta attraverso un confronto visivo di biomassa vegetale tra trattato e controllo della stessa popolazione ^{25, 28} non trattati. Un punteggio, che vanno da 10 a piante non interessati dalla erbicidi (rispetto al controllo non trattato) a 0 quandole piante sono chiaramente morti, è dato a ciascun vassoio trattata.
2. Popolazioni attribuiscono a quattro categorie sulla base dei risultati ottenuti dai trattamenti con due dosi di erbicidi: S quando meno del 5% delle piante sono sopravvissuti i 1x dosi di erbicidi, SR quando i sopravvissuti variava dal 5% al ​​20% a 1x dosi di erbicidi, R quando più di il 20% delle piante è sopravvissuto alle 1x dosi di erbicidi e RR quando i sopravvissuti sono più del 20% alla dose di erbicida 1x e oltre il 10% alla dose di erbicida 3x ^17.

Risultati

Per valutare lo stato di resistenza di una popolazione resistente putativo, è fondamentale comprendere un controllo suscettibile nel test per verificare l'efficacia erbicida. I risultati di un test di screening condotto su P. popolazioni rhoeas, un'erba infestante campi di grano, sono riportati in Figura 2, in cui l'efficacia di quattro erbicidi post-emergenza su un assegno suscettibile (09-36) e sul sospetta una resistenza (10-91) sono rappresentati. Popolazione 09-36 è stato completa...

Discussione

Diversi passaggi all'interno dei protocolli sono critici per una valutazione di successo di resistenza agli erbicidi in una popolazione: 1) semi devono essere raccolti quando sono maturi da piante sopravvissute trattamento erbicida (s). Maturazione dei semi sulla pianta madre è fondamentale per evitare difficoltà nella germinazione del seme più tardi; 2) la corretta conservazione dei semi si consiglia di evitare la proliferazione di muffe che potrebbero impedire la germinazione; 3) piantine devono essere trattati al...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sacchetti di carta	Celcar SAS
Piatti in plastica	ISI plast S.p.A.	SO600	Plastica trasparente
Acido solforico 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Tessuto non tessuto	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Peso 17 g m-2
Cloroformio >99,5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Nitrato di potassio >99,0%	Sigma-Aldrich	P8394
Contenitori in plastica	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Vassoi in plastica	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Vassoi in polistirene	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 celle rotonde (6x4)
Solfato di rame	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas
Torba	Blu Agroingross sas	TORBA250
Cabina di germinazione	KW	W87R
Ugelli	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	Il secondo tipo di ugelli viene utilizzato solo per il generatore di
codici a barre	glifosato Toshiba TEC	SX4
Etichette con codice a barre	Felga	TT20200	Stick-in etichette con angoli arrotondati
Lettore di codici a barre	Cipherlab	8300-L	Terminale dati portatile
Irroratrice			Costruito in casa
Erbicidi inclusi nei risultati:
Prodotto commerciale	Principio attivo	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact da utilizzare con Hussar WG
Dash		BASF	Surfact da utilizzare con Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glifosato	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact da utilizzare con Granstar e Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro