L'impianto di Miniosmotic Pompe e consegna di traccianti Tract allo Studio Riorganizzazione Cervello in condizioni fisiopatologiche

Sommario

Per studiare la riorganizzazione cerebrale in condizioni patologiche, abbiamo utilizzato pompe miniosmotiche per la consegna diretta di proteine nel cervello, aggirando la barriera ematoencefalica. I traccianti del tratto vengono quindi iniettati per studiare le alterazioni della connettività cerebrale sotto l'influenza della proteina.

Abstract

Il trattamento farmacologico in modelli animali di malattia cerebrale impone il problema di protocolli di iniezione ripetuti che possono indurre stress negli animali e provocare livelli tissutali impermanenti del farmaco. Inoltre, la somministrazione di farmaci al cervello è delicata a causa della barriera ematoencefalica (BEE), riducendo così significativamente le concentrazioni intracerebrali di farmaci selettivi dopo la somministrazione sistemica. Pertanto, un sistema che consenta sia la somministrazione costante del farmaco senza picchi di livello e l'elusione della BBB è al fine di raggiungere concentrazioni intracerebrali sufficientemente elevate di farmaci impermeabili alla BEE. In questo contesto, le pompe miniosmotiche rappresentano un sistema ideale per la somministrazione costante di farmaci a una velocità fissa nota che elude il problema dello stress iniettivo quotidiano negli animali e che può essere utilizzato anche per la somministrazione diretta di farmaci al cervello. Qui, descriviamo un metodo per l'impianto di pompe miniosmotiche e l'assistenza postoperatoria che dovrebbe essere fornita agli animali per applicare con successo questa tecnica. Incorporiamo il suddetto paradigma sperimentale nelle procedure standard utilizzate per studiare la neuroplasticità all'interno del cervello dei topi C57BL6. Pertanto, abbiamo esposto gli animali a un infarto cerebrale di 30 minuti e impiantato con pompe miniosmotiche collegate al cranio tramite una cannula per somministrare un farmaco pro-plasticità. I test comportamentali sono stati eseguiti durante 30 giorni di trattamento. Dopo la rimozione, gli animali hanno ricevuto iniezioni di traccianti del tratto anterogrado per analizzare la plasticità neuronale nella fase cronica del recupero. I risultati hanno indicato che la neuroprotezione da parte del farmaco somministrato è stata accompagnata da un aumento delle fibre motorie che attraversano la linea mediana del cervello nelle strutture bersaglio. I risultati affermano il valore di queste tecniche per la somministrazione di farmaci e gli studi di plasticità cerebrale nelle moderne neuroscienze.

Introduzione

Il rilascio di proteine e composti farmacologici nel cervello sono strategie importanti per studiare i meccanismi alla base delle malattie cerebrali e valutare molecole candidate per nuovi trattamenti ^1,2. Nelle neuroscienze sperimentali, la somministrazione di vettori come plasmidi o adenovirus è diventata uno strumento importante per studiare le azioni a lungo termine delle proteine nel cervello ^3,4. Le singole iniezioni di vettori presentano il vantaggio di un sistema che da solo mantiene livelli altamente stabili dell'agente terapeutico nel cervello ⁴. Tuttavia, per esperimenti a lungo termine con farmaci purificati, la somministrazione sistemica per iniezione intraperitoneale induce stress nei topi o nei ratti, e non è la scelta migliore quando è necessaria una risposta cerebrale mirata, richiedendo anche grandi dosi di farmaco⁵. Le pompe miniosmotiche rappresentano un sistema ideale per la somministrazione diretta prolungata di farmaci nel cervello, eludendo sia la bassa accessibilità al cervello che i picchi di concentrazione del farmaco, poiché la somministrazione del farmaco avviene direttamente in un punto mirato del cervello e ad una portata fissa determinata dal modello di pompa scelto^2,6,7. Infatti, questo sistema ci ha permesso di studiare con successo il recupero cerebrale dopo l'ictus attraverso la somministrazione di diversi farmaci come l'eritropoietina umana ricombinante (rhEpo) e il fattore di crescita endoteliale vascolare ^6,7.

La plasticità cerebrale è essenziale per il ricablaggio delle connessioni in risposta alle lesioni cerebrali. La plasticità è un concetto ampio che spazia dalla formazione o eliminazione di contatti sinaptici, alla crescita di spine dendritiche e anche all'allungamento o alla retrazione di connessioni a lunga distanza^8,9. In precedenza si credeva che il cervello non fosse in grado di ricostruire le connessioni dopo una lesione. Tuttavia, molti approcci hanno dimostrato che, se adeguatamente stimolato, può ristabilire la connettività ^6,7,10. Una tecnica particolarmente utile per studiare questo è l'uso di traccianti del tratto. I traccianti del tratto anterogrado sono composti che possono entrare nei neuroni al soma e poi distribuirsi lungo tutti gli assoni fino a quando questi non raggiungono le loro strutture bersaglio. Due esempi sono il blu a cascata (CB) e il destrano ammina biotinilato (BDA). Al contrario, i traccianti retrogradi del tratto, come la tossina B del colera (CTB) o il fluorogold (FG) entrano nel neurone attraverso il terminale dell'assone e poi si distribuiscono nuovamente al soma, rivelando così il sito di origine dei neuroni che prendono di mira il sito di iniezione.

Qui, presentiamo i metodi che utilizziamo per l'impianto di pompe miniosmotiche per la somministrazione diretta di proteine o farmaci che hanno potenziali effetti sulla plasticità neurale, nonché l'iniezione di BDA e FG per svelare connessioni di input e output alla corteccia motoria. Il BDA sarà anche utilizzato come esempio di tracciante del tratto utilizzato per dimostrare una maggiore plasticità degli assoni che emergono dal co dopo l'ictus sotto trattamento rhEpo.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l'approvazione del governo (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 e G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) sulla base di linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione di Miniosmotic Pumps

1. In un ambiente sterile (es., Cappa coltura cellulare), avere la pompa, catetere, flusso moderatore, cervello infusione cannula ei dischi distanziatori da utilizzare (Figura 1).
2. Per la consegna di farmaci direttamente nei ventricoli utilizzare un disco distanziatore in modo che solo la punta dell'ago cannula è in contatto con il ventricolo. Tenere la cannula testa in giù con una pinza. Aggiungere due gocce di collante cianoacrilato (CA) e di introdurre un disco distanziatore.
3. Lasciare la cannula su una superficie piana rivolta verso l'alto in modo che la colla tra il disco distanziatore e si asciuga cannula.
4. Tagliare il catetere in sezioni di circa 2,5 cm.
5. Per EApompa ch, preparare un minimo di 300-350 microlitri della soluzione di interesse in quanto sarà necessario per riempire completamente la pompa estrusione così tutta l'aria all'interno di esso per evitare la formazione di bolle all'interno del catetere. bolle impedire il flusso del soluzione nel cervello.
6. Connettersi con attenzione il catetere al moderatore flusso.
7. Usando una siringa 2 ml collegata all'ago fornito dal kit di infusione cerebrale, riempire la pompa finché una piccola quantità di soluzione sfugge pompa, evitando bolle d'aria al suo interno.
8. Riempire con cura il moderatore di flusso e il catetere prestare attenzione per evitare eventuali bolle rimanenti all'interno del catetere.
9. Introdurre il moderatore flusso all'interno della pompa.
10. Una volta riempito, collegare accuratamente la cannula all'estremità del catetere. Se si osserva che una bolla si forma rimuovere la cannula e accuratamente riempire il catetere con veicolo o soluzione medicinale e poi reintrodurre la cannula.
11. Posizionare il pump in un contenitore con soluzione salina sterile e lasciare a 37 ° CO / N.
12. Prima dell'impianto ricontrollare per la formazione di bolle. In caso di necessità (es., Si osservano le bolle) togliere la cannula e riempire il tubo. Ricollegare la cannula. Questo dovrebbe prendere solo pochi microlitri di soluzione.

2. Impianto di Miniosmotic Pumps

Nota: Per questi esperimenti animali sono stati anestetizzati dell'1% isoflurano (30% O _2, 70% N _{2 O).} Tuttavia, se questo non è disponibile, l'uso di iniezioni intraperitoneali di anestesia è possibile anche ^11.

1. Individuare l'animale nel dispositivo stereotassica in anestesia e coprire gli occhi con una pomata di protezione per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia osservando una mancanza di risposta nel hindpaw quando viene premuto con le dita o con una pinzetta. Non procedere fino a quando l'animale è completamente addormentato.
2. Tagliare la pelliccia sopra la luiannuncio sia con le forbici o una macchina da barba. Tagliare il più possibile senza danneggiare la pelle.
3. Pulire la pelle con il 70% di etanolo e disinfettante con proprietà antibatteriche e fungicide.
4. Con un bisturi aprire un 1 cm un'incisione leggermente a destra della linea mediana ed esporre il cranio.
5. Pulire il cranio con un batuffolo di cotone. Bagnare con il 70% di etanolo e passarlo sul cranio. Ciò indurrà il cranio ad asciugare.
6. Se il cranio ha leggero sanguinamento, utilizzare un cauterizer per eliminare eventuali punti sanguinanti. Sangue impedisce il CA da asciugare correttamente sull'osso volta la cannula è impiantato.
7. Utilizzare il dispositivo stereotassica per fare un segno sul punto del cranio dove sarà impiantato cannula. Per le infusioni ventricolari sulle coordinate dell'emisfero sinistro sono -0.2 mm caudale, 0.9 mm lateralmente al bregma (Figura 2A).
8. Forare delicatamente sopra il cranio facendo un angolo di 45 °; questo impedisce il trapano da accidentalmente entrare nel brain. Forare più volte per alcuni secondi e poi controllare quanto profondo il buco è. Fermare perforazione una volta che il cranio è stata assottigliata, ma ancora non pienamente penetrato.
9. Rompere le meningi con la punta di un ago sterile fino a raggiungere il pieno accesso al cervello. Farlo con delicatezza in modo da non danneggiare il cervello.
10. Pulire il cranio con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone.
11. Introdurre una pinza diritte sotto la pelle dell'animale in senso antero-caudale. Utilizzare le pinze per aprire lo spazio sotto la pelle nella parte posteriore dell'animale dove verrà impiantata la pompa. Introdurre la pompa nel dorso dell'animale lasciando il catetere e la cannula esterna (Figura 2B). La pompa rimane in questa posizione fino a che non viene rimosso e non necessita di alcun tipo di fissaggio.
12. Posizionare con cura quattro piccole gocce di colla accanto al ago nella cannula.
13. Introdurre con cautela l'ago attraverso il cranio senza spostarlo lateralmente. Tenerlo in posizione per 15-30 secondi uino la cannula sia completamente inserito (Figura 2C.1). Una volta sul posto, la cannula raggiungerà 2,5 mm in direzione ventrale dorso se è stato utilizzato un disco distanziatore. Se collegato correttamente, la cannula rimarrà attaccato all'osso fino alla fine dell'esperimento.
14. Mettere un dito sulla scheda rimovibile e quindi utilizzare l'altra mano per tagliarla per il collo con una serie di forbici (figura 2C.2).
15. Chiudere la ferita sulla pelle con un 5-0 sutura e aggiungere alcune gocce di soluzione di povidone-iodio (PVP-I) sopra la ferita per prevenire l'infezione (Figura 2D).
16. Spostare l'animale in una nuova gabbia. Non mettere animali operati con gli animali che non sono ancora stati operati. Tenere gli animali che sono stati impiantati con le pompe da soli nelle loro gabbie durante il periodo di somministrazione del farmaco.
17. Non lasciare incustoditi i topi fino a quando sono svegli e hanno riguadagnato decubito sternale.

3. Pompa removal

Nota: Di solito l'esperimento si concluderà alla fine del tempo di consegna consentito dalla pompa, tuttavia è possibile rimuovere la pompa per fare esperimenti secondari come un seguito al rilascio del farmaco. Per fare iniezioni traccianti tratto è quindi necessario rimuovere la pompa.

1. Posto l'animale nel dispositivo seterotactic sotto anestesia e coprire gli occhi con pomata di protezione per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia osservando una mancanza di risposta nel hindpaw quando viene premuto con le dita o con una pinzetta. Non procedere fino a quando l'animale è completamente addormentato.
2. Aprire con cautela la pelle tagliando attraverso l'incisione fatta nel giorno della pompa dell'impianto.
3. Con una pinza chirurgica tenere la cannula ed estrarlo. Dovrebbe essere facilmente rimosso dal cranio. Come ci si aspetta sanguinamento dolce, fermarlo mettendo un batuffolo di cotone e attendere per 1-2 min.
4. Estrarre la pompa dal catetere. Luilp venire fuori spingendola, creando una pressione sulla pelle.
5. Chiudere la ferita di nuovo con un 5-0 sutura e aggiungere qualche goccia di PVP-I.
6. Spostare l'animale in una nuova gabbia. Non mettere animali operati con gli animali che non sono ancora stati operati. Gli animali che hanno subito un intervento chirurgico possono essere messi insieme.
7. Non lasciare incustoditi i topi fino a quando sono svegli e hanno riguadagnato decubito sternale.
8. Permettere agli animali di recuperare per 10 giorni prima di procedere all'iniezione tratto tracciante.

4. Pressione Tract Tracer iniezione a 45 ° sulla destra Motor Cortex

1. Posto l'animale sul dispositivo stereotassico in anestesia e coprire gli occhi con una pomata di protezione per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia osservando una mancanza di risposta nel hindpaw quando viene premuto con le dita o con una pinzetta. Non procedere fino a quando l'animale è completamente addormentato.
2. Aprire la ferita alla testa.
3. Cappoggiare il cranio con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone.
4. Introdurre una siringa di vetro 5 microlitri (26S ga) sul supporto verticale del dispositivo. Assicurarsi che l'estremità inferiore del supporto di vetro è proprio il pezzo azienda. La siringa non deve essere troppo al di sotto come allora sarà impossibile metterlo a 45 ° dalla posizione verticale ed eseguire l'iniezione.
5. Orientare la siringa direttamente sopra bregma e quindi individuare le coordinate desiderate. Per un'iniezione sulle coordinate corteccia motoria sono: Punto # 1: +0,5 mm e 2,5 mm rostrale laterale rispetto al bregma. Punto # 2: 1,34 millimetri rostrale, 2,5 millimetri laterale rispetto al bregma.
6. Una volta che le coordinate sono stati localizzati, indicare la loro posizione sul cranio con un pennarello con punta sottile. Fare un solo punto nel cranio, come eccessivo rilascio inchiostro potrebbe nascondere la coordinata corretto.
7. Forare il cranio con attenzione tenendo la punta a 45 °. Come nella fase 2.8, controllare il teschio di frequente in modo che non sia completamente perforated per evitare danni al cervello causata dal trapano. Utilizzare la punta di una siringa per garantire che tutti osseo è stato rimosso.
8. Caricare 600 nl del tratto di diluizione tracciante nella siringa.
9. Regolare la posizione verticale a 45 ° verso il lato destro dell'animale. Al microscopio, posizionare la punta dell'ago della siringa del proprio di fronte al foro.
10. Spostarlo nella direzione verticale di 1,5 mm. Lasciare l'ago stabile in questa posizione per 30 secondi a 1 minuto prima di fare iniezioni pressione.
11. Iniettare 300 nl di diluizione tracciante in tre passi di 100 nl separate l'una dall'altra da 30 sec. Dopo l'ultima iniezione, lasciare la siringa costante per 30 sec per 1 min per evitare il tracciante a fluire fuori dal cervello.
12. Lentamente tirare fuori la siringa, spostare sopra il secondo foro e ripetere lo stesso processo con il restante 300 nl che sono all'interno della siringa.
13. Dopo la seconda iniezione, rimuovere la siringa e procedere a chiudere la wouND con un 5-0 sutura e aggiungere qualche goccia di PVP-I.
14. Spostare l'animale in una nuova gabbia. Non mettere animali operati con gli animali che non sono ancora stati operati. Gli animali che hanno subito un intervento chirurgico possono essere messi insieme. Non lasciare incustoditi i topi fino a quando sono svegli e hanno riguadagnato decubito sternale.
15. Permettere agli animali di recuperare per 10 giorni prima di sacrificio.

5. Tract Tracer osservazione

1. Anestetizzare l'animale completamente secondo le linee guida istituzionali. Confermare anestesia osservando una mancanza di risposta nel hindpaw quando viene premuto con le dita o con una pinzetta. Non procedere fino a quando l'animale è completamente addormentato.
2. Profumato gli animali con paraformaldeide 4% in PBS (pH 7) sotto protocolli standard ^6.
3. Rimuovere la correzione cervello e post-it da O / N immersione in paraformaldeide al 4%.
4. Cryoprotect cervelli in saccarosio al 30% fino a quando il cervello affondare. Quindi rimuovere i cervelli e congelarli da 10 sec immersion in azoto liquido. Mantenere cervelli a -80 ° C fino sono prodotte sezioni.
5. Produrre le sezioni a 20 micron per retrogrado analisi del tratto tracciante e a 40 micron per anterograda analisi tratto tracciante sezionando un cryostate.

Nota: FG marcato i neuroni possono osservare come cellule bianche sotto la luce ultravioletta di eccitazione. BDA è rilevato da O / N incubazione con un complesso avidina-biotina-perossidasi e 3,3 'diaminobenzidina con aggiunta di nichel al 0,4% per migliorare il contrasto delle fibre ^6,7.

Risultati

Abbiamo sottoposto animali per 30 min di occlusione dell'arteria cerebrale media dal metodo di sutura intraluminale indurre una lesione nello striato sinistra e poi trasportato rhEPO direttamente nel cervello per mezzo di pompe miniosmotic (Figura 1, Figura 3) per 30 giorni a partire 3 giorni dopo ictus ^6. La figura 4 mostra uno schema del tratto cortico vertebrale che è stata tracciata dopo CB e BDA iniezione e la zona in cui sono stati iniettati rivelatori. Abbiamo mostrato un miglioramento della forza di presa e delle prestazioni del motore (Figura 5) dopo 14 e 42 giorni dalla consegna rhEPO rispettivamente. Consegna del BDA nella corteccia destra del motore di animali che hanno ricevuto un colpo sul striato sinistra, ha mostrato un aumento fibre motorie che attraversano la linea medio a livello del nucleo rosso e facciale (figura 5), dimostrando successo colorazione di germinazione fibre come una conseguenza del trattamento farmacologico con miniosmotPompe ic. trattamento rhEPO anche aumentato la sopravvivenza neuronale, in ritardo astrocitosi diffusa, ridotta formazione di cicatrici gliali e aumentato l'angiogenesi nel periodo preso in esame ^6. Utilizzando la stessa tecnica iniettabile tratto tracciante possiamo rilevare successo nuclei talamici che sono collegati alla corteccia mediante iniezione del tracciante retrogrado tratto FG (Figura 6).

Si possono osservare Figura 1. Componenti della pompa miniosmotic utilizzato in questo protocollo. Il disco distanziale, cannule e scheda rimovibile, catetere, flusso moderatore e pompa miniosmotic. L'aspetto della pompa completamente assemblata può essere visto in Figura 2A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Sintesi della pompa di impianto punti chiave. (A) Il mouse viene mostrata come posto sul dispositivo stereotassico con la pompa miniosmotic completamente costruito accanto ad essa. La freccia indica le coordinate selezionate per l'impianto. (B) La pompa è stata introdotta sul dorso dell'animale e solo la cannula rimane all'esterno. Il cranio è già stato perforato. (C) Aspetto della testa dopo l'impianto. (C.1) La cannula è in posizione, ma nella scheda rimovibile non è stato tagliato. (C.2) La linguetta rimovibile è stato tagliato e cucitura la ferita può iniziare. (D) L'asterisco indica un animale recentemente impiantato rispetto ad un animale 30 giorni dopo l'impianto (#). Quando alloggiata correttamente, la ferita dovrebbe rimanere chiuso fino al termine della procedura, come illustrato nell'immagine.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Nissl indica il sito di impianto sulla corteccia. Una piccola incisione può osservare sulla parte della corteccia sinistra (freccia). La larghezza della zona è di circa 50 penetrato micron. La sono evidenti alterazioni tissutali gravi basato su Nissl rispetto all'area corrispondente controlaterale (*). R: emisfero destro. L: emisfero sinistro. Scala bar = 300 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Tracttracciante strategia di iniezione come pubblicato prima da Reitmeier et al. ^6,7. (A) Schema siti di iniezione che indicano per il tracciante tratto BDA alla corteccia motoria controlaterale mentre CB è stato iniettato nella corteccia motoria dell'emisfero infartuato. Fibre sono stati seguiti per il nucleo rosso (non mostrato) e il nucleo facciale (vedere Figura 5). (B) Il sito di iniezione del tracciante anterogrado BDA tratto vicino alla corteccia motoria è mostrato. Notare la freccia rossa che indica il percorso dell'ago mentre la freccia nera mostra alcuni cellule corticali etichettati con il BDA. Cx: Cortex. CC: del corpo calloso. V: ventricolo. FN: nucleo facciale. Barra di scala in B = 200 micron. Figura 4A è riprodotto per gentile ^6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Il recupero di un cervello infartuata dopo la consegna del rhEPO. (A) BDA iniettato nella corteccia motoria controlesionale viene rilevato in fibre corticobulbar a livello del nucleo facciale (Bregma -5.8 mm a -6.3 mm). Linee di intersezione in ogni emisfero sono stati elaborati parallelamente alla linea mediana e le fibre che attraversano ogni linea in direzione all'emisfero ipsilesionale e controlesionale sono state contate e espressa in percentuale del totale delle fibre marcate nel tratto corticospinale. L'eritropoietina aumentata incroci in fibra in direzione alle controlesionale dati nucleo facciali sono mezzi + - SD. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA seguita da meno significativi test differenze, §p <0.05 rispetto ai topi non ischemiche veicoli trattati. (B) il comportamento del motore hanno mostrato un miglioramento della forza di presa della mano e il coordinamento nel test di canna rota. I dati sono valu medies + - SD. I dati sono stati analizzati mediante due vie misure ripetute ANOVA, seguita da ANOVA / meno significativi test differenze per ogni time-point. §p <0.05 rispetto al basale di pre-ischemica; * P <0.05 rispetto al veicolo topi trattati ischemiche. Figure 5A e B sono riprodotte per gentile ^6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. strutture bersaglio raggiunti dopo l'iniezione di fluorogold (FG). (A) del sito di iniezione di FG accanto alla corteccia motore come indicato nella figura 1. Notare la freccia rossa indica il percorso dell'ago e la freccia bianca indica alcune cellule marcate in la corteccia. (B) FG iniettato vicino al motorecorteccia viene rilevato VPL. Fi: Fimbria. IC: capsula interna. RT: talamiche nucleo reticolare. VPL: talamiche ventrale postero nucleo. Scala bar = 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Per molti anni, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come l'ictus ischemico o traumi cerebrali si è concentrata sullo sviluppo di terapie neuroprotettive che mirano a promuovere la sopravvivenza neuronale nella fase ictus acuto. La stragrande maggioranza delle terapie farmacologiche che sono stati trovati per essere efficace in modelli di roditori falliti quando tradotto in clinica. Ragioni di questo fallimento terapeutico comprendono ma non si limitano alla mancanza di effetti prolungati della droga con conseguente persistere recupero neurologico funzionale. E 'quindi importante sviluppare strategie di promozione rimodellamento del cervello nel lungo periodo. Poiché la promozione di sopravvivenza neuronale da sola non è sufficiente per consentire tempi di recupero di successo, come suggerito dal gran numero di prove neuroprotezione infruttuosi, la stimolazione di plasticità neuronale ha recentemente ottenuto grande interesse nel campo.

Mezzi per la consegna della droga sono l'iniezione intraperitoneale, coda i intravascolarenjection, iniezione femorale, iniezione stereotassica singolo di vettori nel cervello e ha continuato la consegna costante da pompe miniosmotic. Quest'ultimo può includere rilascio sistemico, se la pompa non ha una cannula, o che possono essere organo diretto, come abbiamo dimostrato per la consegna nel cervello. Con l'eccezione delle pompe miniosmotic e l'uso di vettori virali, tutte le altre strategie indurranno concentrazioni del farmaco fluttuanti. Per gli esperimenti a lungo termine diventa così necessario sottoporre l'animale allo stress di ricevere iniezioni frequenti. Il BBB impone un ostacolo importante per l'assorbimento del cervello di proteine ​​o farmaci dal sangue, con la conseguente necessità di enormi proteine ​​o droga dosaggi per raggiungere concentrazioni terapeutiche nel cervello. Per esempio Pellegrini et al. (2013) ⁵ consegnato rhEPO mediante iniezione intraperitoneale ad una dose equivalente a 75 UI / die per un animale di 30 g (750 IU / giorno per un 300 g ratto). In confronto, la consegna di RHEP miratao al cervello ci ha permesso di usare una dose molto più bassa di soli 10 UI / die nel nostro studio per tempi di recupero di successo, che ci ha permesso di ottenere il recupero su larga scala volta ad un tasso fisso di 0,25 ml / h.

In questo lavoro abbiamo dimostrato il metodo di impianto di minipompe con una cannula collegata al cranio, al fine di consegnare la plasticità promuovere proteina rhEPO direttamente nel ventricolo, eludendo così il BBB. Con questo metodo, rhEPO promosso recupero neurologico in un certo numero di modi, compresa la riduzione delle dimensioni dell'infarto, riduzione della formazione di cicatrici gliali e induzione di angiogenesi. rhEPO inoltre promosso la sopravvivenza neuronale ed ha aumentato le proiezioni dalla corteccia motoria controlesionale verso il nucleo rosso denervata e nuclei facciali. La germinazione delle fibre è stata rivelata mediante iniezione del tracciante anterogrado BDA tratto nella corteccia motoria (Figure 4A e 5A). Una correlazione funzionale alla germinazione delle fibre è provided dal miglioramento delle capacità motorie (Figura 5B). Inoltre, abbiamo dimostrato che lo stesso approccio per iniezione tratto tracciante può essere applicato per svelare talamo-corticale connessioni per iniezione del tracciante retrogrado tratto FG (Figura 6B).

Nella preparazione della pompa miniosmotic, è fondamentale considerare il punto di destinazione e l'impiego di distanziali. Usiamo un distanziale per ridurre la lunghezza dell'ago 0,5 millimetri come in questo modo sulla punta dell'ago è in contatto con il ventricolo nelle coordinate indicate (-0,2 mm caudale, 0,9 mm laterale 2.5 mm dorso ventrale, con rispetto al bregma). Tuttavia, se le strutture più profonde sono il bersaglio della ricerca, quindi non saranno necessari distanziatori. Analogamente, se un punto più esterno di mandata è desiderato (es., La corteccia), quindi più dischi distanziatori sarà necessario. Il catetere deve essere sufficientemente lungo in modo che la pompa non è troppo vicino alla testa, poiché impedirà movimenti del mouse, ma anche non troppo lungo quanto una volta impiantato lunghezza eccessiva può provocare il catetere per piegare, aumentando così il rischio di rimozione cannula dal movimento naturale del mouse. Una sezione di 2 cm di catetere dà ottimi risultati in termini di mobilità e stabilità dell'impianto (figure 1 e 2). L'incubazione della pompa a 37 ° CO / N consente alla pompa di avviare immediatamente pompare il farmaco nel cervello al momento dell'impianto.

Nella pompa impiantazione miniosmotic è fondamentale per assicurare che il cranio è asciugato correttamente prima di impiantare la cannula. Di solito la pulizia con il 70% di etanolo indurrà l'osso ad asciugare, ma se non si trova il sanguinamento continuo, sfiorando il cranio con un cauterizer sarà completamente asciugare. È fondamentale assicurare che l'introduzione dell'ago è verticale e lentamente possibile. Una volta in posizione, e mentre la colla sta asciugando, posizionando il dito sulla parte superiore della cannula impedisce di muoversi lateralmente over il cranio. Particolare attenzione deve essere data alla ferita e il posizionamento della cannula. È importante che l'incisione non viene eseguita esattamente sopra la linea mediana del cranio ma leggermente sul lato destro. Quando si chiude la ferita, se l'incisione è stata fatta alla linea mediana, la pelle sarà overstretched, aumentando così il rischio di apertura della ferita. Rendere leggermente l'incisione su un lato permetterà i punti di sutura di essere lontano dalla parte più alta della cannula. Di conseguenza ci sarà meno tensione sui punti di sutura e la ferita guarire correttamente. Gli animali devono essere in gabbia da solo e controllati ogni giorno, soprattutto durante i primi 10-15 giorni dopo l'impianto. In caso di deiscenza della ferita, ferite devono essere chiusi al più presto. Se la cannula viene rimossa o l'animale presenta un'infezione, l'esperimento deve essere terminato. Reimpianto della cannula non è raccomandato. E 'molto importante per impianto di successo utilizzare adeguate quantità di tessuto annunciocolla per (non troppo!) come degrada l'osso e aumenta il rischio di rimozione cannula. Tuttavia usando troppo poco adesivo anche non tenere la cannula attaccata all'osso. Le pompe possono trasportare farmaci miniosmotic disciolti in un ampia varietà di sostanze, essendo l'unica limitazione a questo che il solvente è biocompatibile. Inoltre, dato che il volume è piccolo (200 ml) si deve determinare se la concentrazione richiesta per l'esperimento è adatto e non provocare precipitazione all'interno della pompa.

Tract tracciando sia con anterograda o retrograde traccianti è una tecnica molto ben definito per studiare connettività cerebrale e la plasticità. La cura deve essere data ai fotogrammi uso stereotactic l'iniezione per assicurare l'accuratezza sul targeting l'area del cervello che si vuole studiare (ad esempio, per evitare che l'iniezione sul corpo calloso quando si inietta la corteccia).

Per tutti gli interventi chirurgici e per ridurre il dolore einfiammazione, gli animali devono essere trattati con 0,1 mg / kg Buprenorfina prima dell'intervento e Caprofen a 4 mg / kg una volta al giorno per tre giorni dopo l'intervento.

In conclusione, questo approccio fornisce uno strumento adeguato per lo studio dell'effetto delle proteine ​​o composti farmacologici nel cervello danneggiato, che rappresenta un metodo che è adatto per gli studi sulla plasticità cerebrale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pompa miniosmotica Alzet. Modello 2004.	Alzet	000298	Contenitore per farmaci
Kit per infusione cerebrale 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Sistema di somministrazione cerebrale per farmaci
Loctite  454 Gel prismatico	Loctite	45404	Adesivo cianoacrilato per l'adesione della cannula al cranio
Siringa in vetro 75N	Hamilton	87900/00	Iniezione di traccianti del tratto
Biotina Destrano Ammina (10.000 MW)	Sonde molecolari	N-7167	Tracciante del tratto anterogrado
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Tracciante retrogrado del tratto
Quintessential Stereotassico Iniettore (QSI)	Stoelting	53311	Dispositivo stereotassico per la determinazione delle coordinate, l'impianto della pompa e l'iniezione del tracciante del tratto.