Articolo metodologico

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

DOI:

10.3791/52934

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29 luglio 2015

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1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

In questo articolo

Sommario

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La demielinizzazione focale viene indotta nel nervo ottico utilizzando la microiniezione di lisolecitina. I potenziali evocati visivi vengono registrati tramite elettrodi del cranio impiantati sulla corteccia visiva per esaminare la conduzione del segnale lungo la via visiva in vivo. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure chirurgiche alla base dell'impianto di elettrodi e della microiniezione del nervo ottico.

Abstract

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La registrazione del potenziale evocato visivo (VEP) è ampiamente utilizzata nella pratica clinica per valutare la gravità della neurite ottica nella sua fase acuta e per monitorare il decorso della malattia nel periodo di follow-up. I cambiamenti nei parametri VEP sono strettamente correlati al danno patologico nel nervo ottico. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata del modello di roditore di microiniezione del nervo ottico, in cui viene prodotta una lesione da demielinizzazione parziale nel nervo ottico. Vengono inoltre discusse le tecniche di registrazione VEP. Utilizzando elettrodi impiantati nel cranio, siamo in grado di acquisire tracce VEP riproducibili durante e tra una sessione e l'altra. I VEP possono essere registrati su singoli animali per un periodo di tempo per valutare i cambiamenti funzionali nel nervo ottico longitudinalmente. Il modello di demielinizzazione del nervo ottico, in combinazione con il protocollo di registrazione VEP, fornisce uno strumento per studiare i processi patologici associati alla demielinizzazione e alla rimielinizzazione e può potenzialmente essere impiegato per valutare gli effetti di nuovi farmaci rimielinizzanti o terapie neuroprotettive.

Introduzione

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La neurite ottica è una delle forme più comuni di neuropatia ottica, che causa la perdita totale o parziale della vista1. Istologicamente, è caratterizzata da demielinizzazione infiammatoria, perdita assonale delle cellule gangliari retiniche e vari gradi di rimielinizzazione nel nervo ottico2. La neurite ottica è solitamente l'esordio manifesto della sclerosi multipla. Il potenziale evocato visivo (VEP) è uno strumento non invasivo per studiare la funzione del sistema visivo. Riflette la funzione post-retinica dalla retina alla corteccia visiva primaria ed è influenzata in molte condizioni di malattia del nervo ottico3. Il VEP è stato utilizzato prevalentemente nei pazienti con neurite ottica per valutare l'integrità del percorso visivo4.

La latenza della VEP, che riflette la velocità di conduzione del segnale lungo la via visiva, è considerata una misura accurata del livello di cambiamenti associati alla mielina nel nervo ottico5; mentre si ritiene che l'ampiezza della VEP sia strettamente correlata al danno assonale delle cellule gangliari retiniche (RGC)6. Questa ipotesi è stata abbastanza ben stabilita utilizzando il modello di ratto di demielinizzazione del nervo ottico indotta da lisolecitina5.

Qui, spieghiamo un protocollo completo di tecnica di microiniezione del nervo ottico nei roditori, che può ridurre al minimo il danno correlato alla manipolazione chirurgica al nervo di per sé e ai tessuti adiacenti come i muscoli extraoculari e i vasi sanguigni. Inoltre, l'intervento chirurgico di impianto di elettrodi cranici è stato descritto per la registrazione VEP negli animali7. Le registrazioni VEP possono essere eseguite ripetutamente sugli animali per un periodo di tempo per valutare i cambiamenti correlati alla demielinizzazione/rimielinizzazione e l'impatto sull'integrità assonale nel nervo ottico.

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici e gli orientamenti della Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e sono stati approvati dalla Animal Comitato Etico della Macquarie University.

1. VEP elettrodi impianto

  1. Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg).
    Nota: Dopo l'induzione dell'anestesia, osservare i riflessi di prelievo (test pizzico, riflessi cornea e della palpebra, ecc) e la loro assenza come indicazione per iniziare un intervento chirurgico. Monitorare continuamente gli animali in tutta la chirurgia e amministrare anestetico supplementare (10% della dose di ketamina iniziale per top-up) se sono presenti i riflessi. Ratti adulti (> 12 settimane) sono usati negli esperimenti.
  2. Radere la pelle della zona chirurgica.Posto l'animale su un blocco di riscaldamento (37 ° C) per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Preparare la pelle attraverso l'applicazione topica di povidone-iodio. Applicare drappeggio chirurgica. Applicare attualità pomata oftalmica per prevenire la secchezza della cornea in anestesia generale. Mantenere asepsi utilizzando strumenti sterili.
  3. Effettuare una incisione cutanea longitudinale sulla linea mediana della pelle testa. Eliminare il tessuto connettivo, per ottenere una buona esposizione del cranio.
  4. Con cautela, praticare dei piccoli fori radica manualmente utilizzando un trapano micro mano a 7 mm dietro il bregma e 3 mm lateralmente alla linea mediana.
  5. Elettrodi vite implantare attraverso il cranio nella corteccia (area 17), penetrando la corteccia ad una profondità di circa 0,5 mm. Impiantare un elettrodo di vite di riferimento sulla linea mediana 3 mm rostrale al bregma. Applicare cemento dentale di racchiudere e fissare le viti (non sempre necessario).
  6. Suturare la pelle della testa, amministrare pomata antibiotica sulla pelle e consentire all'animale di recover dall'anestesia su un blocco di riscaldamento.
    Nota: In alternativa, gli elettrodi possono essere lasciati esposti, in modo che la pelle non deve essere riaperto in ogni registrazione. Immediatamente al momento della cessazione di un intervento chirurgico, ma prima del recupero anestetico, somministrare un farmaco non steroideo anti-infiammatori (FANS) (se non somministrato in fase preoperatoria) o un analgesico oppiaceo. Monitorare gli animali costantemente fino al pieno recupero da anestetico e completamente ambulatoriale.
  7. Lasciare almeno 1 settimana per gli animali di recuperare da un intervento chirurgico prima della registrazione VEP.

2. Optic Nerve iniezione

  1. Anestetizzare l'animale, preparare la pelle e applicare drappeggio come sopra (1.1 e 1.2).
  2. Fare un 1 a 1,5 cm incisione nella pelle sopra l'orbita di un occhio selezionata casualmente. Aprire il tessuto sottocutaneo per raggiungere la cavità orbitale con iris sottili forbici. Aprire la congiuntiva e la capsula di Tenon anteriore sotto il microscopio operatorio.
  3. Ritrarre la extraocularemuscoli e ghiandole lacrimali intraobital per esporre circa 3 mm di lunghezza del nervo ottico. Aprire la dura madre e materia aracnoide strati attorno al nervo ottico longitudinalmente utilizzando una lama oftalmica.
  4. Inserire la pipetta di vetro nel nervo ottico ad una distanza di 2 mm posteriormente al globo. La micropipetta di vetro è attaccato ad una siringa Hamilton.
  5. Iniettare 1% lisolecitina (0,4-1,0 microlitri, con 0,02% di blu di Evan che non ha effetti sulla mielinizzazione) lentamente nel nervo circa per un periodo di 30 sec.
  6. Suturare la incisione cutanea. Applicare una pomata antibiotica per prevenire l'infezione. Occhi Compagni possono essere serviti come controlli interni per le registrazioni elettrofisiologiche.
  7. Mettere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia.

3. VEP registrazione

  1. Anestetizzare l'animale e preparare la pelle come 1.1 e 1.2.
    Nota: Lower dose di anestetici può essere utilizzato per reco elettrofisiologicarding (ketamina 40 mg / kg e medetomidina 0,25 mg / kg).
  2. Mettere il topo in una stanza buia e permettono di adattarsi al buio per 5-30 min. In alcuni casi, i ratti possono rispettivamente essere scuro O adattato / N per scotopica o la luce adatta per le registrazioni fotopica VEP 8.
  3. Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 ° C dal sistema coperta homoeothermic con una sonda termometro rettale.
  4. Dilatare le pupille con 1,0% tropicamide collirio. Aprire la pelle sopra il cranio per accedere al pre-posto in elettrodi vite situ.
  5. Collegare la vite sulla corteccia visiva controlaterale dell'occhio stimolata e la vite riferimento all'amplificatore. Inserire un elettrodo ago nel coda come la terra. Misurare e mantenere l'impedenza dell'elettrodo sotto 5 kΩ.
  6. Mettere uno stimolatore mini-Ganzfeld direttamente sulla pelle intorno alle palpebre per fornire l'isolamento occhio superiore 7. L'illuminazione dello stimolatore necessario calibrare anticipoda un fotometro.
  7. Invia stimolazione luminosa attraverso lampi di luce 100 volte alla frequenza di 1 Hz, con impostazioni del filtro passa-banda bassa e alta di 1 e 100 Hz, rispettivamente. La frequenza di campionamento del segnale è a 5 kHz.
    Nota: I segnali devono essere campionati almeno a circa 250-300 Hz per garantire che più di due campioni vengono raccolti durante ogni ciclo.
  8. Suturare la pelle posteriore e tenere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia. La registrazione può essere ripetutamente registrati su singoli animali per monitorare le variazioni funzionali per un periodo di tempo.
  9. Al punto finale, somministrare una iniezione sovradosaggio di pentobarbitone sodio (100 mg / kg, ip) euthanize all'animale. Conferma eutanasia arresto cardiaco, arresto respiratorio e diminuzione della temperatura corporea.

4. Preparazione del tessuto e Istologia

  1. Rimuovere i nervi ottici da animali eutanasia sotto il microscopio e fissare il tessuto in 1% paraformaldeide O / N.
  2. Lavare accuratamente i tessuti con soluzione fisiologica. Trattare il tessuto in un processatore automatico ed incorporare in paraffina. Sezioni tagliate (5-10 micron) utilizzando un microtomo rotativo.
    Nota: per studio immunoistochimica, fissare il tessuto in 1% paraformaldeide, lavare con soluzione fisiologica e incubare con il 30% di saccarosio O / N. Tessuto Incorpora in OCT mezzo di inclusione e fare criosezioni utilizzando un criostato.
  3. Incubare sezioni 0,1% soluzione blu veloce come il Luxol (nel 95% di etanolo) O / N a 56 ° C. Differenziare le sezioni a 0,05% di carbonato di litio per 30 sec e poi 70% di etanolo per altri 30 sec. Infine, colorazione di contrasto in soluzione violetto cresolo 0,1% per 30 sec prima di montare sezioni. Utilizzare la veloce colorazione blu per identificare mielina nel nervo ottico 5.

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Risultati

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Riproducibili PEV tracce intra-sessione sono mostrati in Figura 1 e un significativo ritardo nella latenza N1 possono essere osservati dopo l'iniezione nervo ottico. Lesioni del nervo ottico parziali di demielinizzazione può essere osservato su sezioni istologiche utilizzando Luxol veloce colorazione blu 5. La Figura 2 mostra una sezione rappresentativa con una piccola lesione demyelinated focale nel centro del nervo ottico. Si noti che la sezione trasversale non rappresenta ...

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Discussione

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Il nervo ottico è molto suscettibile ai danni meccanici. La lesione da schiacciamento del nervo ottico per una durata di 1 s può portare a circa il 75% di perdita di RGC in un periodo di 2 settimane10. Pertanto, è necessaria estrema cura durante l'esecuzione delle procedure chirurgiche. Secondo l'esperienza degli autori, è molto meglio adattare un approccio di dissezione smussata per esporre e farsi strada attraverso i tessuti intorno al nervo ottico lungo l'orientamento del nervo, piuttosto che penetrare in u...

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Dichiarazioni

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Nessuno degli autori ha interessi in competizione o in conflitto.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal oftalmica Research Institute of Australia (ORIA). Ringraziamo il Prof. Algis Vingrys e il dottor Bang Bui, Università di Melbourne, per primo ci aiuta a sviluppare la tecnica di registrazione VEP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ketamina 100 mg/ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidina 1 mg/ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropicamide 1,0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
Sistema di coperte omeotermicheHarvard ApparatusNC9203819
Misuratore di impedenza GrassF-EZM5
Elettrodi a vite Micro FastenersM1.0&volte; Elettrodi ad ago sottodermico da 3 mm con fessura CSK M/T 304 S/S
 ErbaF-E3M-72
Riparazione rapida DeguDent GmbH
Diodo a emissione luminosa NichiaNSPG300A
BioamplificatoreCWE, Inc.Sistema BMA-400
CEDCambridge Electronic Design, Ltd.Siringa di Hamilton Power1401
 Hamilton87930
LysolecithinSigmaL4129
Evan' s blu SigmaE2129

Riferimenti

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