Qui, miriamo selettivamente agli anticorpi contro un membro specifico di una famiglia di proteine altamente conservata, immunizzando gli animali con le loro regioni più divergenti, seguiti dalla rimozione di anticorpi reattivi incrociati mediante pre-adsorbimento.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Produzione di Nurr-1 specifici anticorpi policlonali gratuito di cross-reattività contro i suoi omologhi, Chiudi Nor1 e Nur77
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sottofamiglia 4 del recettore nucleare (NR4A) è composta da 3 proteine correlate che condividono un dominio di legame del DNA (DBD) e un dominio di legame del ligando (LBD). La proteina 1 correlata al recettore nucleare (Nurr1 o NR4A2) svolge un ruolo chiave nel mantenimento del sistema dopaminergico. Le disfunzioni della dopamina associate al gene Nurr1 includono, tra le altre, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la depressione maniacale. Inoltre, prove recenti indicano che Nurr1 è espresso anche in altre aree cerebrali come l'ippocampo e svolge un ruolo fondamentale per l'apprendimento e la memoria. Gli altri membri della famiglia sono il fattore di crescita nervoso IB (Nur77 o NR4A1) e il recettore orfano 1 di derivazione neuronica (NOR1 o NR4A3). Per aiutare a studiare i precisi ruoli funzionali di Nurr1 nelle disfunzioni neuronali dopaminergiche e in altre regioni cerebrali, erano necessari anticorpi privi di reattività crociata contro Nur77 e NOR1. Poiché le proteine sono più divergenti nei loro LBD che nei loro domini di legame al DNA, l'immunizzazione con LBD purificati dovrebbe produrre anticorpi specifici per Nurr1 con reattività minime contro Nur77 e/o NOR1. Sebbene gli anticorpi anti-Nurr1 siano stati generati con successo, questi hanno mostrato una significativa immunoreattività contro gli altri membri della famiglia. La cromatografia di affinità su proteina A immobilizzata seguita da pre-adsorbimento contro LBD immobilizzati di Nur77 e NOR1 ha prodotto anticorpi specifici per Nurr1 privi di cross-reattività. Qui, indirizziamo selettivamente gli anticorpi contro un membro specifico di una famiglia di proteine altamente conservata, immunizzando gli animali con le loro regioni più divergenti, quindi rimuovendo gli anticorpi reattivi incrociati mediante pre-adsorbimento. L'obiettivo del protocollo è quello di aumentare la specificità degli anticorpi policlonali attraverso il pre-adsorbimento contro antigeni cross-reattivi.
Introduzione
Il fattore di trascrizione Nurr1 e suoi omologhi (Nur77 e Nor1) appartengono al recettore nucleare sottofamiglia 4A (NR4A) 1. Essi sono anche i recettori orfani perché i loro ligandi endogeni non sono ancora identificati. Nurr1 è stato clonato nel 1992 e, anche se si sa essere espressa nel cervello 2, il suo ruolo essenziale per lo sviluppo e la manutenzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato rivelato da studi sui topi knockout 3. Inoltre, il suo ruolo importante per il mantenimento dei neuroni dopaminergici del mesencefalo è stato recentemente dimostrato da uno studio KO condizionale 4. A causa di queste ele....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Nota: la composizione di tutte le soluzioni citate di seguito può essere trovato nella Tabella Materiali / attrezzature.
1. Proteina A Colonna anticorpi Purificazione
- Equilibrare una proteina A Spin Column e tutti i buffer necessari a temperatura ambiente per 15 minuti prima di iniziare la procedura.
- Diluire il siero immune 1: 1 con Proteina A IgG Binding Buffer. (5 ml di siero è consigliato).
- Battere delicatamente una proteina A Spin Column sul banco per rimuovere la resina che può essere presentato nel tappo. Togliere il tappo superiore e far scattare delicatamente la chiusura di fondo. Porre la colonna in....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un confronto di proteine una colonna purificato anticorpi specifici Nurr1 con proteina purificata a anticorpi anti-Nurr1 seguita da passaggio attraverso Nur77 LBD e Nor1 LBD colonne è mostrato in figura 1. Come si vede, proteina A-purificato anticorpi Nurr1 mostrato un forte legame di Nurr1 LBD. Tuttavia, ha anche mostrato significativo legame Nur77 LBD e Nor1 LBD. Quando gli anticorpi della proteina A-purificata Nurr1 sono stati ulteriormente purificati contro Nur77 LBD e Nor1 LBD, l'affinità fin.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il successo di questo protocollo si basa sulla disponibilità di proteine pure per la caratterizzazione degli anticorpi sollevati contro un determinato membro della famiglia delle proteine di interesse. Non vi è alcuna necessità di purificare gli anticorpi utilizzando proteina A / G finché non è chiaramente dimostrato che sussistono notevoli reazioni crociate di ELISA e Western blotting.
Come indicato nel testo, è importante evitare che sospende la proteina (s) di essere reticolato alla c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH (NS070577 e NS084869).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dominio di legame del ligando purificato da Nurr1, Nor 1 e Nur77 | Soluzione di stoccaggio della colonna | ||
| AminoLink Coupling Resin e kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Colonna di spin Protein A | Thermo Scientific | 89978 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Corning | 21-031-CV | |
| 96 pozzetti Piastre a fondo flate, flangia alta, 330 μ l | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Siero di capra normale | KPL | 50-675-69 | |
| Diluente di latte/ Concentrato bloccante | KPL | 50-82-01 | |
| Tampone di eluizione IgG | Thermo Scientific | 21004 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA | Thermo Scientific | 23235 | |
| Rafano Perossidasi coniugata di capra anti-coniglio IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Resina Ni-NTA | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetrametilbenzidina | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Proteina A IgG Cuscinetto legante | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Colonna Soluzione | Fosfato tamponato Soluzione salina contenente azoturo di sodio allo 0,02% | ||
| Tubi per dialisi pretrattati Spectra/Por 7 | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Colonne monouso | Thermo Scientific | 29924 | |
| Tampone di accoppiamento AminoLink 0,1M | fosfato di sodio, 0,05% NaN3, pH 7,0 | ||
| Tampone | 1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4 | ||
| Soluzione | 1M NaCl, 0,05% NaN3 | ||
| Tampone | 1% Siero di cavallo normale (NHS), 1% Siero di capra normale (NGS) in 1X diluente di latte KPL | ||
| Soluzione | di conservazione PBS pH 7,4 contenente 0,02% di azoturo di sodio | ||
| Micropipette: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ |
Riferimenti
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Anticorpi specifici per Nurr1rimozione della cross reattivitpurificazione del dominio di legame del ligandocromatografia di affinit con Proteina Atecnica di pre adsorbimentoanalisi ELISA e Western Blotcolonne LBD di Nur77 e NOR1potenziamento della specificit anticorpalericerca sul sistema dopaminergicosottofamiglia 4A dei recettori nucleari
