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Articolo metodologico

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DOI:

10.3791/52969

⸱

6 ottobre 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

In questo articolo

Sommario

La co-infezione umana è difficile da replicare in vitro. Tuttavia, i parassiti della malaria umana possono essere facilmente coltivati in vitro, così come le cellule mononucleate del sangue periferico umano appena isolate e naturalmente infettate dall'HIV. Ciò fornisce un modello eccellente per studiare le risposte immunitarie precoci ai parassiti della malaria nel contesto della co-infezione da HIV.

Abstract

La co-infezione da malaria e HIV è una priorità sanitaria crescente. Tuttavia, la maggior parte della ricerca sulla malaria o sull'HIV si concentra attualmente su ciascuna infezione individualmente. Sebbene sia fondamentale comprendere le dinamiche della malattia per ciascuno di questi agenti patogeni in modo indipendente, è anche importante che le interazioni tra questi agenti patogeni siano studiate e comprese.

Abbiamo sviluppato un modello versatile in vitro di co-infezione HIV-malaria per studiare le risposte immunitarie dell'ospite alla malaria nel contesto dell'infezione da HIV. Il nostro modello consente lo studio dei fattori secreti nei surnatanti cellulari, nella superficie cellulare e nei marcatori proteici intracellulari, nonché dei livelli di espressione dell'RNA. Il disegno sperimentale e i metodi utilizzati limitano la variabilità e promuovono l'affidabilità e la riproducibilità dei dati.

Tutti i patogeni utilizzati in questo modello sono patogeni umani naturali (Plasmodium falciparum e HIV-1) e tutte le cellule infette sono naturalmente infettate e utilizzate fresche. Utilizziamo eritrociti umani parassitati con P. falciparum e mantenuti in coltura continua in vitro. Otteniamo cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate da volontari con infezione cronica da HIV. Ogni condizione utilizzata ha un controllo appropriato (P. falciparum parassitato vs. eritrociti normali) e ogni donatore infetto da HIV ha un controllo HIV non infetto, da cui le cellule vengono raccolte lo stesso giorno. Questo modello fornisce un ambiente realistico per studiare le interazioni tra i parassiti della malaria e le cellule immunitarie umane nel contesto dell'infezione da HIV.

Introduzione

Co-infezione, infezione da infezioni multiple concomitanti, è la norma in ambienti naturali. Co-infezione può avere un grande impatto sulla patologia della malattia e sulla gestione clinica di ogni infezione. Nel contesto di co-infezione, il vaccino e l'efficacia dei farmaci, così come test diagnostico, può essere influenzato negativamente (rivisto in 1). Tuttavia, nonostante la sua importanza, la maggior parte delle ricerche patogeno ritiene infezioni solo singoli.

La malaria e HIV-1 (HIV) sono le principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale. Aree di malaria e l'HIV endemicità condividono una vasta sovrapposizione geografica, mettendo a milioni di persone a rischio di co-infezione e di conseguenza a rischio di più grave malattia clinica 2-10. Le due malattie interagiscono negativamente. Negli individui affetti da HIV, la carica virale HIV più alti e le diminuzioni temporanee CD4 + T-cellule può essere visto nel corso di una infezione della malaria, mentremalaria oneri parassita e il rischio di malaria clinica e grave sono più alti in co-infettati individui 2,3,5,7,8,10. I meccanismi attraverso i quali l'HIV aumenta la malaria gravità non sono pienamente compresi e meritano ulteriori indagini.

Qui si descrive un metodo con cui la malaria e la co-infezione HIV possono essere studiati in vitro. In particolare, questo metodo consente per l'esame delle risposte immunitarie specifiche per malaria nel contesto dell'infezione da HIV. Il nostro protocollo descrive un sistema versatile di co-coltura con cellule mononucleate del sangue periferico appena isolate (PBMC) isolati da donatori infetti cronicamente da HIV e in vitro colta P. falciparum parassitati eritrociti (PfRBC). L'impatto dell'HIV terapia antiretrovirale nelle risposte può essere esaminata usando PBMC prospetticamente raccolti da HIV (+) i donatori pre e post-terapia.

Abbiamo usato questo sistema per studiare l'impatto dell'infezione da HIVsulle risposte immunitarie innate specifiche malaria 11,12, e sono stati in grado di determinare che IFNγ e TNF risposte specifiche per malaria sono alterate nelle cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T da HIV (+) i donatori pre e post-HIV terapia antiretrovirale . Inoltre, siamo stati in grado di utilizzare questo sistema per determinare che le funzioni monocitiche sono anche compromesse HIV (+) i donatori, ma recuperare post-HIV terapia antiretrovirale.

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Protocollo

Questo protocollo richiede il reclutamento di donatori di siero e RBC da utilizzare per la cultura parassita, e l'HIV (+) e non infetti donatori per l'isolamento PBMC. Institutional Review Boards devono approvare tutti gli studi e tutti i donatori devono fornire il consenso informato prima di prelievo di sangue.

ATTENZIONE: Lavorare con campioni di sangue umano e dei parassiti della malaria umana richiede misure precauzionali. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti, e lavorare in un armadio di livello 2 biosicurezza. In caso di accidentale esposizione percutanea a malaria umana, riferire alla Salute e Sicurezza per il trattamento profilattico. Ulteriori considerazione la sicurezza dovrebbe essere messo in atto per lavorare con l'HIV (+) nel sangue. Indossare un camice da laboratorio chiusura posteriore. Doppio guanto (guanto superiore deve essere in lattice). Eseguire tutte manipolazione in un armadio di livello 2 biosicurezza. Non utilizzare vetro o oggetti appuntiti. Non utilizzare aspiratore. Metti i prodotti contaminati in soluzione virox o candeggina per un minimo di 1 ora prima dello smaltimento.Lavare tutte le superfici con virox e UV per 1 ora dopo l'uso. Si noti che ogni istituzione avrà i propri regolamenti di biosicurezza specifici che devono essere seguite. Segnala tutte le esposizioni accidentali al sangue con infezione da HIV di salute e sicurezza per la valutazione e la considerazione di eventuali profilassi post-esposizione.

Nota: I diversi ceppi di P. esistono parassiti della malaria falciparum. ITG è stato utilizzato per questi esperimenti, ma diversi ceppi può essere utilizzato. Eccellenti le istruzioni su di congelamento e scongelamento Plasmodium falciparum parassiti sono disponibili sul sito MR4 13.

1. Fare RPMI-A per Parassita della malaria Cultura

  1. Rendere RPMI-0 mescolando 950 ml di DDH 2 O, 1 pacchetto di polvere RPMI-1640, 6 g di HEPES, 2 g di bicarbonato di sodio e 1,35 mg di ipoxantina.
  2. Calore disgelo inattivato siero umano da due diversi donatori. Donatori AB sono i migliori, ma qualsiasi possono essere usati se i parassiti sono coltivate in tipo Oglobuli rossi (RBC). Capovolgere i tubi a mescolare. Se siero contiene particelle o è girare di spessore a 2.000 giri e poi filtrare parte liquida con una unità di 0,45 micron filtro.
  3. Utilizzando un filtro unità 0,2 micron filtro 180 ml di RPMI-0, 20 ml di siero umano (10 ml da ciascun donatore) e 0,5 ml di 10 mg / ml di gentamicina.
    Nota: Siero umano può intasare il filtro in modo più di una unità di filtro può essere richiesto.
  4. Etichettare la bottiglia con mezzo RPMI-A, la data e la fonte del siero. Mettete in frigorifero fino al momento. RPMI-A può diventare torbida in frigorifero. Questo è normale, ma con aumento della nuvolosità è un segno di contaminazione.
    Nota: la crescita del parassita può variare nel siero del donatore diverso. E 'una buona idea per testare tutti i lotti di siero umano per la buona crescita del parassita prima di utilizzare.

2. Preparare le cellule umane rosso sangue per Parasite Cultura

Nota: i donatori di sangue devono essere di tipo O.

  1. Raccogliere 7-10 ml di sangue in acido-cit(ACD) tubi di tasso-destrosio. Scrivi ID e data di raccolta sull'etichetta del donatore.
  2. Sangue Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare il sangue per le culture di parassiti entro 1 mese.
  3. Pulire la parte superiore del tubo con etanolo al 70%. Rimuovere con cautela il tappo e scartare. Trasferire sangue in una provetta da 15 ml. Spin per 3 minuti a 1000 x g. Rimuovere il plasma mediante aspirazione.
  4. Sospendere RBC a parità di volume di caldo RPMI-0. Spin per 5 min a 1000 x g. Rimuovere il buffy coat per aspirazione, risospendere in 5 ml di RPMI-0 e ripetere il lavaggio altre 2 volte.
  5. Rimuovere il surnatante e aggiungere abbastanza RPMI-A per produrre una miscela che è del 50% in volume RBC.
  6. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.

3. Mantenere Culture Parasite

  1. Preriscaldare RPMI-A a 37 ° C.
  2. Posizionare parassiti scongelati (vedi protocollo MR4 per la procedura di scongelamento) in un pallone T25 con 5 ml di RPMI-A e 75 ml di RBC lavato umana per un ematocrito del ~ 3%.Nota: ematocrito misura il volume di RBC rispetto al volume totale. Per calcolare ematocrito misurare il volume di imballato RBC al volume totale del mezzo più RBC. Si supponga che i parassiti scongelati contribuiranno 75 ml di RBC. Aggiungendo 150 ml di RBC magazzino (che è equivalente ad aggiungere 75 ml di imballato RBC) al pallone c'è un totale di 150 ml di RBC in 5 ml di mezzo, che equivale ad un ematocrito del 3% (150 ml / 5.000 microlitri x 100% = 3%).
  3. GAS il pallone per 30 sec con miscela di gas parassita (1% O 2, 3% di CO 2, equilibrio N 2). Sigillare e posizionare il lato largo beuta giù a 37 o C incubatore da consentire un'ampia superficie di scambio di gas.
  4. Per cambiare il supporto e controllare parassitemia (deve essere fatto ogni giorno), spostare con cautela il pallone come per non disturbare lo strato di RBC. Utilizzando uno sterile scollegato pipetta Pasteur trarre fuori il terreno di coltura senza disturbare lo strato di sangue.
  5. Per controllare parasitemia, rimuovere un campione di 10 microlitri dallo strato di sangue, posizionarlo su un vetrino e con un secondo vetrino creano un film sottile di sangue. Lasciare asciugare diapositiva.
  6. Collocare 4 ml di fresco RPMI-A nel pallone, miscelare delicatamente, gas per 30 sec, e posto in incubatore a 37 ° C.
  7. Colorare il vetrino utilizzando il kit di colorazione Hema3 secondo il protocollo del produttore.
    1. Per la colorazione ottimale, dip scorre nella soluzione di fissaggio per 10 sec, soluzione che per 10 sec, e la soluzione II per 30 sec. Risciacquare con acqua e lasciare scivoli ad asciugare.
  8. Calcola parassitemia contando il numero di PfRBC (macchiato viola scuro) rispetto al numero totale di RBC (rosa macchiata). Contare un totale di 300 cellule per garantire la precisione.
  9. Quando parassiti hanno raggiunto un parassitemia di 5%, espandere la cultura in un pallone T75, utilizzando 40 ml di RPMI-A, e 500 ml di RBC.

4. Parasite Sincronizzazione

Nota: Il giorno prima tegli sperimentare, sincronizzare la cultura parassita trattando con alanina. Solo parassiti fase anello e non infetti RBC sopravvivranno questo trattamento. Sincronizzazione alanina vi darà una coltura pura trofozoite il giorno dopo che può essere utilizzato negli esperimenti di co-coltura. Assicurati di iniziare con una cultura parassita che contiene la maggior parte dei parassiti fase anello.

  1. Preparare la soluzione alanina miscelando 8,01 g di alanina (300 mM) e 0,365 g di Tris (10 mM) in 300 ml di DDH 2 O. Portare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare utilizzando una unità di 0,2 micron filtro.
  2. Soluzione alanina Preriscaldare a 37 ° C.
  3. Spin giù la cultura parassita (5 min x 1.000 xg), e rimuovere il mezzo.
  4. Risospendere pellet in 19 volumi di soluzione alanina (1 ml imballati RBC a 19 ml di soluzione alanina). Incubare per 15 minuti a RT.
  5. Spin 5 min x 1.000 x g. Aspirare il surnatante. Lavare in RPMI-0 una volta. Aspirare il surnatante e risospendere in RPMI-A e regolare ematocrito a ~ 3%. Solcome pallone e ritorno a 37 ° C.
    Nota: Per gli esperimenti di co-coltura è necessario un minimo di parassitemia 5% trofozoiti, con il 10% parassitemia considerato ottimale.

5. Parasite e RBC preparazione per esperimenti di co-coltura

  1. Utilizzare un rapporto di 3 PfRBC per PBMC in esperimenti di co-coltura per indurre una risposta infiammatoria. Per calcolare totale PfRBC, quantificare parassitemia facendo una sottile striscio di sangue come descritto al punto 3.5, ed ematocrito contando il numero di RBC per ml di cultura parassita con un emocitometro.
    Numero di PfRBC =% parassitemia x totale RBC / ml x ml di cultura. Ad esempio: 10 ml di coltura a 10 x 10 6 RBC / ml e 10% parassitemia è pari a 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
  2. Spin cultura parassita per 5 minuti a 1000 xg (RT). Aspirare media, e risospendere alle 6 x 10 6 PfRBC per ml in RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 integrati con L-glutammina e HEPES, il 10% di caloreFBS inattivato, 1,5 ml gentamicina, 5 ml di 100 mM sodio piruvato, 5 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali, 5 ml di 5 mM β-mercaptoetanolo).
  3. Prendere sangue di controllo (non infetto RBC dallo stesso donatore utilizzato per mantenere la cultura parassita), calcolare ematocrito e risospendere in RPMI-S + allo stesso numero di RBC per ml come la cultura parassita.

6. Isolamento di cellule mononucleari di sangue periferico umano (PBMC)

  1. Raccogliere il sangue venoso in tubi di eparina sodica (top verde) sia da un virus HIV (+) del donatore cronica e uno di HIV (-) di controllo. Non usare EDTA come un anti-coagulante come azione chelante del calcio EDTA colpisce la funzione delle cellule. In media si aspettano tra 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml di sangue. Per un tipico esperimento raccogliere 30 ml di sangue da ogni donatore. Il volume di sangue dovrà essere regolata a seconda delle esigenze sperimentali.
  2. Nel più breve tempo possibile e sicuramente entro un'ora di sangue che viene raccolto,rimuovere il sangue dai tubi e posto in un tubo di plastica da 50 ml. I monociti, in particolare, saranno attivati ​​e bastone al vetro, quindi è importante che le cellule, se vengono utilizzati tubi di raccolta del sangue vetro vengono rimossi il più rapidamente possibile.
  3. Spin il sangue a 1.000 xg per 15 minuti e raccogliere il plasma (questo può essere usato per altri studi, se necessario - se non questo passaggio può essere saltato). Diluire il sangue in volume uguale di DPBS fredda.
  4. Mettere 15 ml di Ficoll RT in una provetta da 50 ml. Lentamente, con una pipetta di trasferimento sterile in plastica, strato della soluzione / DPBS sangue sul Ficoll senza alcuna miscelazione. Un massimo di 25 ml di soluzione / DPBS sangue può essere sovrapposto su ogni 15 ml di Ficoll.
  5. Spin i gradienti per 30 minuti a RT a 600 x g. Assicurarsi che l'impostazione 'no freno' è acceso.
  6. Una volta che le cellule hanno filato, cercare l'interfaccia tra le due fasi. Questo è dove il PBMC sono. Utilizzando uno sterile trasferimento pipetta di plastica raccogliere le PBMC dall'interfaccia (vediFigura 1). Ridurre al minimo la contaminazione da RBC.
  7. Posizionare cellule raccolte in provette da 50 ml, con non più di 20 ml per provetta. Superiore del tubo fino a 50 ml con DPBS freddo sterile.
  8. Spin le cellule per 10 min a 4 ° C a 300 x g.
  9. Gettare il surnatante, risospendere pellet in 5 ml sterili DPBS freddi e riunire tutte le cellule dello stesso donatore in un tubo. Top fino a 50 ml con DPBS sterile, e ripetere il lavaggio passaggi altre 2 volte.
  10. Risospendere le cellule in 10 ml di RPMI-S + media.
  11. Rimuovere un'aliquota da 20 ml e mescolare con 20 ml di trypan blu. Pipettare 10 ml in un emocitometro e contare le cellule viventi (cellule che non hanno preso il colorante blu - tutte le cellule blu sono morti). Utilizzare un emocitometro per calcolare il numero di cellule in una soluzione come segue.
    Nota: Un emocitometro ha una griglia di dimensioni specificate in modo che l'area coperta dalle linee è nota.
    1. Assicurarsi che il dell'emocitometro sia pulito. Posizionare il vetrino sul countizona ng. Carico 10 ml di soluzione di cellule posizionando la punta della pipetta in uno dei pozzetti a V. L'area sotto la coprioggetto riempirà per capillarità.
    2. Posizionare il emocitometro caricata al microscopio. La griglia completa del dell'emocitometro contiene 9 piazze di 1 mm 2 ciascuno. Contare tutte le cellule all'interno di ogni grande piazza. Se troppe cellule sono presenti, diluire la soluzione ulteriormente e da raccontare.
    3. Calcolare la concentrazione cellulare come segue: cellule totali / ml = (cellule totali contate / # di quadrati) x Fattore di diluizione x 10.000 cellule / ml, ad esempio, (500 cellule / 5 quadrati) x fattore di diluizione di 20 x 10.000 cellule / ml = 20 x 10 6 cellule totali.
  12. Regolare medio una concentrazione finale di 10 x 10 6 per ml (RPMI-S + medio).

7. Malaria / HIV co-infezione Cultura

  1. Piatto 100 ml di PBMC isolate e 400 ml di RPMI-S + mezzo ad un 24-pozzetti (1 x 10 6 PBMC per pozzetto). Garantireche i pozzi sono installati in triplice copia: 3 pozzi per non infetti RBC, 3 pozzi con PfRBC, 3 pozzi di media e 3 pozzi con PMA / Ionomicina. Questo è sia per l'HIV (+) e HIV (-) del campione.
  2. Per la PfRBC pozzi, posizionare 3 x 10 6 PfRBC in ciascun pozzetto (500 microlitri della cultura parassita preparati in 5.2).
  3. Per non infetti RBC pozzi, mettere 500 ml di cultura RBC non infetti preparato in 5.3 in ciascuno dei pozzetti.
  4. Per pozzi medie, mettere 500 ml di RPMI-S + medie ciascuno dei pozzetti.
  5. Per PMA / Ionomicina pozzi, preparare la soluzione PMA / Ionomicina (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Mettere 500 ml di questa soluzione in ciascun pozzetto.
    Nota: come potenti stimolatori della secrezione di citochine delle cellule T, PMA e Ionomicina sono utilizzati come controllo positivo al fine di garantire le cellule sono funzionali.
  6. Posizionare la piastra a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
  7. Opzionale: utilizzare le cellule in eccesso per l'analisi fenotipica citometria a flusso o conservare in un RNUna soluzione per la futura stabilizzazione analisi di espressione dell'mRNA.

8. Individuazione di malaria immunitarie Risposte

Nota: eseguire esperimenti di co-coltura per tutto il tempo 4 giorni. Non è richiesta alcuna variazione media durante questo periodo. Il punto di tempo ottimale dipenderà dal tipo di cellula di interesse e la domanda posta. Un'incubazione di 12-48 ore è ottimale per le risposte monocitiche a PfRBCs, mentre le risposte linfocitarie sono state meglio osservati a 72-96 ore. I punti di tempo dovranno essere ottimizzato in questione sperimentale. Periodi più brevi (2-4 hr) possono essere utilizzati se l'interazione tra intatto PfRBC e PBMC è di interesse.

  1. Piastra Spin a 300 xg per 3 minuti a cellule pellet. Raccogliere 700 ml di cultura surnatante da ogni pozzetto.
  2. Spin surnatante a 1000 xg per 5 minuti a libera da detriti.
  3. Aliquota schiarì surnatante, se necessario, l'etichetta, e congelare a -20 ° C fino al momento dell'analisi dei fattori secreti è essere perfoconfermate.
  4. Analizzare le risposte di citochine / chemochine mediante ELISA o matrice tallone (seguire i protocolli proposti del produttore).
  5. Raccogliere celle rimanenti nella piastra in una soluzione stabilizzante RNA e utilizzare per l'analisi quantitativa dell'espressione di mRNA mediante real-time PCR 14-16.

9. intracellulare Citometria a flusso per specifiche cellule Ccytokine risposte utilizzando PBMC co-coltura con P. falciparum infetti RBC

Nota: Come menzionato sopra la lunghezza di co-coltura dipenderà dal tipo cellulare di interesse. Se interessati nelle risposte monocitiche per PfRBC un periodo di incubazione più breve è necessario. Tempi saranno più lunghi per le risposte innate linfociti γδ cellule T, cellule NK, cellule NKT), e più ancora per le cellule CD4 e CD8 T. Sarà richiesto di ottimizzazione.

  1. 6-8 ore prima dell'analisi aggiungere 1 ml di 1,000x brefeldina A per tutti i pozzetti. Riportare la piastra a 37 ° C incubatore. Dopo 6-8 ore incubzione, piastra posto in ghiaccio per 15 minuti.
  2. Rimuovere le cellule dai pozzetti con pipettaggio vigoroso e metterli nelle provette microcentifuge etichettati. Raschiare può essere richiesto per rimuovere monociti.
  3. Cellule Spin per 5 min a 1000 x g. Rimuovere surnatanti. Risospendere le cellule in 500 microlitri citometria a flusso tampone (1x DPBS, 2% di calore inattivato FBS, 0,02% di sodio azide).
  4. Le cellule si dividono in modo che ogni campione ha: un tubo per la colorazione anticorpi completo (240 ml), e un tubo per la colorazione fluorescente meno uno (FMO) anticorpo di controllo (240 ml). Pool una piccola quantità di ciascun campione (20 microlitri) per il flusso unstained citometria controllo (questo sarà usato nella creazione del citometro a flusso).
  5. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
  6. Incubare le cellule con CD16 coniugato anti-umano / CD32 (5 mg / ml) in 50 microlitri citometria di flusso buffer per 15 min a 4 ° C per bloccare i recettori Fc.
  7. Aggiungere 1 ml di citometria a flusso buffer per ogni provetta. Spin ceLLS per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
  8. Risospendere le cellule in 50 ml di citometria a flusso tampone con una concentrazione pretitolata di anticorpi fluoroforo coniugati a marcatori di superficie delle cellule desiderate. Soluzione di anticorpi sufficiente pre-mix per tutti i campioni da colorare. Incubare le cellule a 4 ° C per 20 min. Proteggere da light.Note: Importo di ciascun anticorpo dovrà essere ottimizzato. Noi abitualmente macchia per CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumi titolati per questi anticorpi sono riportati in Tabella 1.
  9. Aggiungere 1 ml di citometria a flusso buffer per ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
  10. Aggiungere 100 ml di soluzione di cytofix / Cytoperm ad ogni provetta. Incubare le cellule per 20 min a 4 ° C. Proteggere dalla luce.
  11. Aggiungere 1 ml di tampone perm / lavaggio (fornito come concentrato 10x - portare a 1x con DDH 2 O) ad ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
  12. Aggiungere 100 μl di perm / lavaggio in tubi anticorpo colorazione controllo FMO e mescolare per risospendere le cellule.
  13. Aggiungere 100 ml di tampone perm / lavaggio con una concentrazione pretitolata degli anticorpi coniugati a fluoroforo marcatori intracellulari desiderati (ad esempio, citochine / chemiochine) a tubi pieni di anticorpi colorazione.
    Nota: Quantità di ciascun anticorpo dovrà essere ottimizzata. Noi abitualmente macchia con anti-TNF e anticorpi anti-IFNγ. Volumi titolati per questi anticorpi sono riportati in Tabella 1.
  14. Incubare tutte le provette per 30 min a 4 ° C. Proteggere dalla luce.
  15. Aggiungere 1 ml di tampone Perm / Wash ad ogni provetta. Spin cellule per 5 min a 500 x g. Rimuovere surnatanti.
  16. Risospendere le cellule in 300 microlitri citometria a flusso tampone con 1% paraformaldeide. Lasciate riposare per un minimo di 15 minuti per neutralizzare l'HIV.
  17. Preparare anticorpi singolo campioni colorati utilizzando sfere di compensazione, da utilizzare per la compensazione allestita sul citofluorimetro. Il tipo di compensazioneperline dipenderanno anticorpi usati (es., anti-topo Ig anti-topo / criceto Ig). Perline Vortex. Aggiungere una goccia di perle per anticorpi. Aggiungere la stessa quantità di anticorpi usati per la colorazione. Aggiungere 200 ml di citometria a flusso buffer. Questi sono ora pronti per l'uso. Non c'è bisogno di lavare le perline.
  18. Acquisire campioni su un citometro a flusso il più presto possibile e comunque entro 24 ore per ottenere risultati ottimali. Coloranti tandem sono suscettibili di dissociazione con stoccaggio quindi si consiglia di acquisizione immediata, se possibile.

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Risultati

I grafici rappresentano i livelli di produzione IFNγ da cellule NKT (figura 2), utilizzando CD56 + CD3 + γδ- cancelli avere la popolazione di cellule NKT (dati non mostrati). Le cellule sono state coltivate per 72 ore prima della colorazione. Una volta macchiati, 100.000 cellule CD3 + sono state acquistate sul citofluorimetro di ottenere abbastanza grandi popolazioni di NK, NKT e cellule γδ (cellule di interesse). Un minimo di 5.600 cellule NKT sono visualizzate su ogni grafico. Produzione di TNF è otte...

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Discussione

Il nostro protocollo è stato ottimizzato al fine di studiare più realisticamente la co-infezione HIV-malaria in vitro. In primo luogo, i globuli rossi umani freschi e siero sono necessari per la cultura parassita della malaria. Questo è fondamentale per ottenere una popolazione sana di parassiti della malaria. Lisati parassiti non possono essere sostituiti per i parassiti dal vivo come la produzione di citochine è molto più rapido e intenso quando si utilizza dal vivo P. falciparum infettato R...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

C.A.M.F. e L.S. hanno partecipato alla progettazione del protocollo, all'acquisizione e all'analisi dei dati e alla stesura dell'articolo.

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kain, il Dr. Loutfy, il Dr. Wasmuth e il Dr. Ayi per i loro contributi.

C.F. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. è supportato da un OHTN Junior Investigator Development Award. Il presente lavoro è stato supportato da una sovvenzione operativa del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 e 115160) e da una sovvenzione CIHR New Investigator Catalyst.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anticorpialanina SigmaA7377
(vedi altra tabella)
BD Cytofix/Cytoperm con BD GolgiPlugBD555028include brefeldina A, tampone cytofix/cytoperm e tampone permanente/lavaggio
BD Vacutainer ACD Solution ABD364506
BD Vacutainer Sodium HeparinBD17-1440-02
DPBS (senza calcio, senza magnesio)Corning21-031-CV
Siero fetale bovinoSigmaF1051inattivare a caldo prima dell'uso
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamicina (10 mg/ml)Gibco15710-064
Hema3 Staining SetFisher122-911
HEPESFisherBP310-500
ipossantinaSigmaH9636
IonomicinaSigmaI3909
MEM aminoacidi non essenziali (10 mM)Gibco11140
PMASigma P8139
RPMI-1640 polvereLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 con L-glutammina e HEPESThermo ScientificSH30255.01
bicarbonato di sodio (polvere, coltura cellulare)SigmaS5761
Piruvato di sodio (100 mM)Gibco11360
Tris (base Trizma)SigmaT6066
TrizolAmbion15596018
Trypan Blue (0.4%)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845dipende dagli anticorpi utilizzati
Miscela di gas parassitaPer ordine3% CO2, 1% O2, saldo N2
Equipment
0.2 μ m unità
Vetrini Vetrini
T25
Palloni T75 Fiasche
50 ml
di coltura a 24 pozzetti
scollegate Pipette
tappatePipette Pasteur
pipette sterili per trasferimento emocitometro
citometro
a flusso (3 laser)
Anticorpi utilizzati per citometria a flusso
Anti-TNFeBiosciences551487FITC (fluoroforo) 2 μ l
Anti-IFNγBiolegend506507PE (fluoroforo) 20 μ l
Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (fluoroforo) 1 μ l
Biolegenda anti-CD14; BD Biosciences325624; 551487Biotina (fluoroforo) 0,5 μ l Streptavin PE-TR (fluoroforo) 0,1 μ l
Anti-CD56Biolegend318322PerCP/Cy5.5 (fluoroforo) 5 μ l
Anti-γ δBiolegend331212APC (fluoroforo) 5 μ l
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (fluoroforo) 5 μ l
Anti-CD4Biolegend317424Blu Pacifico (fluoroforo) 1 μ l
speciale filtrante da Piastre Pasteur

Riferimenti

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