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Articolo metodologico

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

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DOI:

10.3791/52976

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13 gennaio 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

In questo articolo

Sommario

Qui un protocollo viene presentato per misurare la cattura batterica da parte delle cellule T CD4 + che si verifica durante la presentazione dell'antigene via transinfection dalle cellule dendritiche pre-infettati (DC). Mostriamo come eseguire i passi necessari: isolamento delle cellule primarie, infezione di DC, DC / T formazione coniugato cellulare, e la misura di batteri trasfezione delle cellule T.

Abstract

Recentemente, abbiamo dimostrato, contrariamente a quanto descritto, che le cellule T CD4+, il paradigma delle cellule immunitarie adattative, catturano i batteri dalle cellule dendritiche infette (DC) attraverso un processo chiamato transinfezione. Qui descriviamo l'analisi del processo di transinfezione, che si verifica durante il corso della presentazione dell'antigene. Questo processo è stato svelato utilizzando cellule T CD4+ da topi OTII transgenici, che portano un recettore delle cellule T (TCR) specifico per un peptide di ovoalbumina (OVAp), che quindi può formare complessi immunitari stabili con cellule dendritiche infette caricate con questo specifico OVAp. La dinamica dei batteri che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) durante la trasmissione delle cellule DC-T può essere monitorata mediante imaging su cellule vive e la quantificazione della transinfezione batterica può essere eseguita mediante citometria a flusso. Inoltre, la transinfezione può essere quantificata con un metodo più sensibile basato sull'uso della gentamicina, un antibiotico aminoglicosidico non permeabile che uccide i batteri extracellulari ma non quelli intracellulari. Questo metodo classico è stato utilizzato in precedenza in microbiologia per studiare l'efficienza delle infezioni batteriche. Spieghiamo qui di seguito il protocollo dell'intero processo, dall'isolamento delle cellule primarie alla quantificazione della transinfezione.

Introduzione

Quando un agente patogeno infetta il suo ospite, di solito c'è una attivazione delle risposte immunitarie innate e adattative, necessari per la liquidazione dei batteri. L'immunità innata è la prima linea di difesa che impedisce maggior parte delle infezioni. L'immunità innata distinguere in precisi elementi di modo che si conservano tra grandi gruppi di microrganismi (modelli molecolari associati ai patogeni, PAMPs) 1. I meccanismi dell'immunità innata sono barriere fisiche come la pelle, i prodotti chimici barriere (peptidi antimicrobici, lisozima) ed i leucociti innate, che includono fagociti (macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche), mastociti, eosinofili, basofili, e le cellule natural killer 2. Queste cellule identificare ed eliminare gli agenti patogeni, sia attaccandoli per contatto o tramite fagocitosi, che comprende patogeno inghiotte e uccisioni. Questo sistema non consente difesa permanente, in contrasto con l'immunità adattativa, che conferisce una memoria immunologica contro pathogens. Il sistema immunitario adattativo è la seconda linea di difesa ed è in grado di riconoscere e reagire ad antigeni specifici di microbica multipla e sostanze non-microbiche 3. I principali componenti del sistema immunitario adattativo sono i linfociti, che includono cellule B e T. Cellule B sono coinvolte nella risposta umorale, secernono anticorpi contro agenti patogeni o proteine ​​esogene. Tuttavia, le cellule T rappresentano l'immunità cellulo-mediata, modulare la risposta immunitaria con citochine secrezione o uccidere cellule del patogeno infettate 4.

Le cellule presentanti l'antigene (APC) tra cui le cellule dendritiche e macrofagi, componenti del sistema immunitario innato, in grado di riconoscere gli agenti patogeni batterici fagocitare e componenti di processo in antigeni, che vengono presentati alla superficie cellulare da parte del Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC) 5-7. Dopo APC hanno fagocitato patogeni, di solito migrano ai nodi linfatici drenante, dove interagiscono con Tcellule. Linfociti T in grado di riconoscere specifici complessi peptide-MHC dai loro recettori delle cellule T. La sinapsi immune (IS) avviene nell'interfaccia tra un antigene APC caricato e un linfocita durante antigene presentazione 8,9. Alcuni batteri possono sopravvivere fagocitosi e diffondere sistematicamente all'interno APC. In questa prospettiva, APC infetti fungono da serbatoi batteriche o "cavalli di Troia" che facilitano la diffusione batterica 10. Il contatto intimo tra APC e linfociti che si svolgono durante il corso di formazione è la funzione anche come piattaforma per lo scambio di parte delle membrane, il materiale genetico e esosomi e può essere dirottato per alcuni virus di infettare le cellule T; questo processo è chiamato transinfection 11-13.

Alcuni batteri patogeni (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica e Shigella flexneri) sono in grado di invadere i linfociti T in vivo e modificare il loro comportamento 14-16. abbiamorecentemente descritto che i linfociti T sono anche in grado di catturare i batteri di transinfection dalle cellule dendritiche precedentemente infettati (DC) nel corso della presentazione dell'antigene 16. T cellule cattura batterica transinfection estremamente più efficace (1,000-4,000x) di infezioni dirette. T cattura cellule patogeni e batteri non patogeni che indica che transinfection è un processo guidato da cellule T. Sorprendentemente, transinfected T (TIT) cellule in rapida ucciso i batteri catturati e lo ha fatto in maniera più efficiente di fagociti professionali 16. Questi risultati, che rompono un dogma di immunologia, mostrano che le cellule dell'immunità adattativa in grado di eseguire le funzioni che erano presumibilmente esclusivo dell'immunità innata. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule tetta secernono grandi quantità di citochine pro-infiammatorie e proteggono dalle infezioni batteriche in vivo.

Qui vi presentiamo i diversi protocolli utilizzati per studiare il processo transinfection battericaun modello di topo. Questo modello è basato sull'impiego di cellule T CD4 + da topi transgenici OTII, che portano una specifica TCR per peptide 323-339 di OVA (OVAp) nel contesto di I-Ab 17 che interagiscono specificamente con l'osso batteri infetti dal midollo DC derivati ​​(BMDCs) 18,19 carichi di OVAp, formando sinapsi immuni stabili.

Transinfection cellule T possono essere visualizzati e monitorati mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, la citometria a flusso può essere utilizzato per rilevare le cellule infettate sfruttando la fluorescenza emessa da batteri che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) 16,20. Inoltre, transinfection cellule T può essere quantificata con un approccio più sensibile, il saggio di sopravvivenza gentamicina che permette di misurare un gran numero di eventi. Gentamicina è un antibiotico che non può penetrare cellule eucariotiche. Pertanto, utilizzando questo antibiotico permette la differenziazione dei batteri intracellulari che è sopravvissuto l'antibiotico aggiunta frquelli extracellulari om che sono stati uccisi 21.

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Protocollo

Nota: le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per la Ricerca Etica della Universidad Autonoma de Madrid e condotto sotto la supervisione della Universidad Autonoma de Madrid Responsabile del benessere degli animali e la salute in conformità alle linee guida spagnole ed europee. I topi sono stati allevati in specifico gratuito (SPF) abitazioni patogeno e sono stati sacrificati da personale addestrato e qualificato che utilizzano anidride carbonica (CO 2) metodo di inalazione.

1. Topo midollo osseo di derivazione DC Differenziazione e infezione

Nota: La figura 1 riassume questo primo passo. Tutte le procedure devono essere effettuate nel cappuccio da questo punto in poi, utilizzando solo i media, strumenti, puntali sterili e piatti della cultura.

  1. Topo midollo osseo DC Differenziazione
    1. Sezionare tibie e femori da un C57 / BL6 del mouse 22 e trasferire in un piatto di plastica con 10 ml di terreno RPMI.
    2. Tagliare ogni epifisi via, con forbici sterili ed esporre il midollo osseo, che ha un colore rosso brillante caratteristica.
    3. Infondere l'interno dell'osso con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0,5% di siero albumina bovina (BSA) e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone PBS / BSA / EDTA) utilizzando una siringa sterile su un Petri sterile piatto.
    4. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare in un tubo a 600 xg in una centrifuga refrigerata (4 ° C).
    5. Risospendere le cellule in 1 ml di cloruro di ammonio-potassio (ACK) tampone di lisi (0,15 M NH 4 Cl, 10 KHCO 3 mM e 0,1 mM EDTA) e incubare per 30 sec a RT per eliminare i globuli rossi.
    6. Aggiungere 10 ml di terreno RPMI 1640 con siero fetale bovino 10% (FBS) e filtrare attraverso un filtro cella (70 micron) per eliminare i frammenti ossei e grumi di cellule prima centrifugazione alla stessa velocità (600 xg) perché ciuffi sono stati eliminati per filtrazione.
    7. Contare le celle und regolare a 5 x 10 5 cellule / ml con RPMI 10% FBS (contenente 50 mM B-mercaptoetanolo, 1 mM sodio piruvato) e aggiungere 20 ng / ml ricombinante murino colony- fattore stimolante granulociti-macrofagi (rm-GM-CSF) come concentrazione finale.
    8. Aggiungi questa sospensione a uno sterile, qualità microbiologica, 15 centimetri piastra di Petri, e la cultura in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% di CO 2).
    9. Ogni tre giorni, spin down sia le cellule non aderenti e cellule indipendenti con 5 mM EDTA in PBS e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml di densità cellulare, con terreno fresco contenente 20 ng / ml rm-GM-CSF.
  2. Maturazione delle DC e Antigen Caricamento
    1. Al giorno 9, sospendere nuovamente le cellule a 5 x 10 5 cellule / ml di densità in mezzo contenente 20 ng / ml rm-GM-CSF. Quindi aggiungere 20 ng / ml di lipopolisaccaride (LPS) per permettere elevata espressione MHC-II su cellule e incubare in un piatto 15 cm sterile Petri cultura trattati non-tessuto per 24 ore.
    2. Dopo unogiorno di LPS-stimolazione, macchia alcune cellule DC con anticorpi contro CD11c mouse MHCII e Gr-1 per controllare DC differenziazione mediante citometria a flusso. Un esempio di analisi citofluorimetrica delle DC è mostrato in Figura 3A e 3B.
      1. Incubare DC (5 x 10 5 cellule / campione) con un anticorpo monoclonale anti-topo-CD16 / CD32 a 2,5 ug / ml di concentrazione finale di 50 microlitri di PBS / BSA / EDTA per campione. In seguito, aggiungere 50 ml di anticorpi contro MHCII (IA / IE), CD11c e Gr-1 coniugato con fluorocromi diversi a 1: 100, 1: 200 e 1: 500 in PBS / BSA / EDTA, rispettivamente.
      2. Infine, lavare DC con PBS / BSA / EDTA e analizzare mediante citometria a flusso, secondo il protocollo del produttore.
        Nota: Se le cellule sono ben differenziate, le cellule sono pronte per l'antigene di carico.
    3. Lavare DC con RPMI 10% FBS (senza antibiotici) e incubare con 10 mg / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) su un tubo di plastica in 1 ml di 10% FBS RMPI medio per 5 x 10 6 cellule dendritiche per almeno 1 ora a 37 ° C. Come controllo negativo, lasciare DC senza incubazione con OVAp.
  3. L'infezione delle DC
    1. Infect DC ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 batteri (10 batteri per DC) per 1 h in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2).
    2. Lavare le cellule DC 3x in PBS 1x e in RMPI 10% FBS e centrifugare a 450 xg per lavare la maggior parte dei batteri extracellulari. Infine, risospendere le cellule in RMPI 10% FBS medio (senza antibiotici) a 20 x 10 6 cellule / ml.

2. Isolamento di linfociti T CD4 + da OTII topi transgenici

Nota: La figura 1 riassume questa seconda fase. I linfonodi devono essere utilizzati al posto di milza per isolare le cellule T CD4 +, in quanto la percentuale di linfociti CD4 + in linfonodos (~ 50%) è maggiore rispetto alla milza (~ 25%) e quindi la purificazione sarebbe più efficace.

  1. Fai la sospensione singola cellula del Linfonodi
    1. Rimuovere inguinali, ascellari, brachiale, del collo dell'utero e la linfa mesenterica nodi da 23 OTII topi transgenici e trasferire in un piatto di plastica con 10 ml di RPMI 10% FBS medio.
    2. Linfonodi Grind sotto una cappa sterile utilizzando due vetrini da microscopio smerigliato. Posizionare linfonodi su un lato smerigliato di un vetrino da microscopio, e strofinare con il lato smerigliato della seconda slitta fino a quando gli organi sono stati terra.
    3. Lavare sospensione singola cellula in tampone PBS / BSA / EDTA.
    4. Filtrare le celle se un filtro cella (70 micron) per rimuovere il tessuto connettivo e lavare con PBS / BSA / EDTA.
    5. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 1 min a RT per eliminare i globuli rossi.
  2. L'isolamento di cellule CD4 + T Cells
    1. Lavare nuovamente come al punto 2.1.3 e conteggiocellule per risospendere in 100 x 10 6 cellule / ml in PBS / BSA / EDTA. Aggiungere anticorpi biotinilati contro CD8, IgM, B220, CD19, MHC di classe II (I-Ab), CD11b, CD11c e DX5 a 1: 250 per 30 min in ghiaccio per la selezione successiva negativo delle cellule T CD4 +.
    2. Lavare le cellule in PBS / BSA / EDTA e incubare le cellule (100 x 10 6 cellule / ml) con microsfere streptavidina alla concentrazione raccomandata in protocollo del produttore per 15 min in ghiaccio.
    3. Lavare le cellule in PBS / BSA / EDTA e filtrare se un colino cella (30 micron) prima di isolamento delle cellule T CD4 +.
    4. Isolare le cellule T CD4 + da selezione negativa utilizzando una macchina di separazione cellulare magnetica secondo il protocollo del produttore.
    5. Contare le cellule e regolare a 4 x 10 6 cellule / ml con RPMI 10% FBS medio (senza antibiotici).
    6. Fissare e tenere in ghiaccio isolato cellule T CD4 + (3 x 10 5 cellule) per verificare la purezza dal flussocitometro come descritto 24. Un esempio di CD4 + T cellule purificazione è mostrato in Figura 3C.

3. T cellulare Transinfection misura dalla Protezione Gentamicina Assay

Nota: La Figura 2 riassume questo terzo gradino del protocollo.

  1. Transinfection cellule T
    1. Incubare isolate cellule T CD4 + con cellule infettate DC (1: 1) (PVS sono stati infettati per 1 ora e lavati per eliminare i batteri gratuito) per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immunitaria in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2).
    2. Aggiungere 0,5 ml di isolate cellule CD4 + T (2 x 10 6 cellule) e 0,1 ml di DC infetti (2 x 10 6 cellule) su una piastra di coltura da 24 pozzetti. Come controllo negativo, infettare direttamente 0,5 ml di cellule CD4 + T ad una MOI di 10 batteri per 30 min.
    3. Includere controlli supplementari che separano DC infettate da linfociti T conuna barriera policarbonato transwell (con 3 micron di dimensione dei pori), impedendo DC-T contatto fisico. Aggiungere 0,1 ml di DC all'interno transwell e 0,5 ml di cellule CD4 + T nel vano inferiore del pozzetto (24-pozzetti).
    4. Infine, completa di RMPI medio fino a quando non vi è di 0,6 ml in ciascun pozzetto per fare volume è uguale in tutti i campioni.
    5. Dopo 30 min di formazione di sinapsi immune, aggiungere 100 ug / ml di gentamicina e incubare per 1 ora prima di raccogliere le cellule in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2).
  2. Re-isolamento di cellule T CD4 +
    1. Raccogliere le cellule non aderenti e risospendere in tampone PBS / BSA / EDTA. La maggior parte delle DC restare attaccata alla piastra di coltura in plastica. Tubi vortex delicatamente per garantire la disgregazione delle cellule. Mantenere 500 ml di surnatante cellulare come controllo per dimostrare che gentamicina ha funzionato bene.
    2. Re-isolare le cellule T CD4 + da campioni che contengono DC e cellule T insieme come al punto 2.2, Anche se la maggior parte del PVS avrebbe dovuto attaccato sulla piastra. Mantenere i campioni di controllo su ghiaccio. Prendere in considerazione solo gli esperimenti di contaminazione inferiore al 2%. Un esempio di CD4 + T cellule purificazione dopo transinfection è mostrato in Figura 3D.
  3. Lyse cellule T e sementi di loro su batteri Piastre medio-agar.
    1. Lavare le cellule T CD4 + due volte con PBS.
    2. Contare le cellule e risospendere a 2 x 10 6 cellule / ml in PBS.
    3. Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 in 500 microlitri di cellule T a loro lisare a 1 x 10 6 cellule / ml, rilasciando i batteri intracellulari fuori delle cellule T.
    4. Fai 3 diluizioni decimali in serie di cellule lisate e sementi 50 ml di ogni diluizione su batteri medie piastre di agar. Dividere le piastre in 4 porzioni e seminare le diverse diluizioni di cellule lisate in ogni sua parte. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4.
      1. Come controllo, anche il piattosurnatante cellulare memorizzato dei coniugati di agar, per garantire che gentamicina ha funzionato bene. Piatto anche DC infetti come controllo supplementare. Nel caso in cui la contaminazione basso PVS si verifica (<2%), sottrarre le unità formanti colonie (CFU) corrispondenti alla contaminazione basso CC.

4. Quantificazione dei T Transinfection cellulare mediante citometria di flusso

Nota: La Figura 2 riassume questo passaggio.

  1. T Transinfection cellulare
    1. Infect BMDCs come al punto 1.3, ma utilizzare GFP esprimere batteri in questo caso.
    2. Stain cellule T CD4 + (isolate da linfonodi al passo 2.2) con un aminocoumarin inseguitore cellulare clorometil (CMAC) per 30 minuti a 37 ºC secondo il protocollo del produttore.
    3. Lavare le cellule T CD4 + etichettati due volte con RMPI 10% FBS (senza antibiotici).
    4. Incubare DC infette (dopo 1 ora di incubazione con i batteri) con etichettato CD4 +Le cellule T per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immune a 37 ° C tra cui tutti i controlli che spiegano al punto 3.1.1.
  2. La colorazione di infetti cellule T CD4 +
    1. Dopo 30 minuti di DC-T formazione di sinapsi immunitaria, raccogliere le cellule e lavarli in PBS / BSA / EDTA.
    2. Dopo due lavaggi con PBS / BSA / EDTA, cellule aggregati separati da vortex delicatamente i tubi.
    3. Fissare i campioni in 0,2 ml / provetta di PBS contenente il 3% PFA per 15 minuti a RT. Poi lavare in PBS.
    4. Incubare con anti-topo-CD16 / CD32 anticorpo monoclonale (2,5 mg / ml) in 50 microlitri / campione di PBS / BSA / EDTA per 15 min in ghiaccio per bloccare i recettori Fc delle cellule dendritiche.
    5. Aggiungere un coniglio anti-batteri anticorpo (10 mg / ml concentrazione finale) in 50 microlitri / campione di PBS / BSA / EDTA per 30 min in ghiaccio per macchiare batteri extracellulari.
    6. Lavare le cellule con PBS / BSA / EDTA e incubare con un anticorpo contro topo coniugato con ficoeritrina CD11c (PE) e seanticorpo condary contro di coniglio coniugato con altri fluorocromo come Alexa-Fluor 647 a 1: 200 in 100 l / campione di PBS / BSA / EDTA per 30 minuti in ghiaccio.
    7. Lavare le cellule e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Non dimenticare di includere un campione di cellule T transinfected utilizzando batteri non fluorescenti come controllo negativo e campioni etichettati con solo uno di ciascuno fluorocromo utilizzato per l'esperimento di compensare i campioni e regolare il flusso citometria impostazioni 25. Analisi rappresentativa è mostrato in Figura 5.
      Nota: Se i batteri non esprimono GFP, per distinguere intracellulare e batteri extracellulari, etichette batteri extracellulari, fissare, e permeabilize campioni con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 5 min. Poi macchia batteri intracellulari totali (+ extracellulari) con un fluorocromo diverso.

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Risultati

Qui abbiamo descritto come eseguire murine cellule T transinfection batterica dal midollo osseo derivate infetto-DC e come misurare transinfection batterica attraverso due diversi approcci: citofluorimetria e gentamicina sopravvivenza saggio Figura 1 riassume la procedura per ottenere le cellule.. DC sono generate da incubazione delle cellule del midollo osseo con GM-CSF per 9 giorni. Poi, DC sono maturata con LPS per aumentare MHCII sulla sua membrana per caricarli in s...

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Discussione

Cellule T o linfociti T sono un tipo di leucociti che svolgono un ruolo centrale nella immunità cellulo-mediata e appartenenti alla risposta immunitaria adattativa 26. Le cellule T sono refrattari alla infezione in vitro, ma alcuni rapporti indicano che possono essere infettati in vivo 14,15. I contatti intimi delle cellule APC e T durante sinapsi immune fungono da piattaforme per lo scambio di materiale biologico 13, tra cui alcuni virus come l'HIV 11. E...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC dal Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione e PIES201020I046 dal Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMIFisher ScientificSH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
Na PiruvatoThermo ScientificSH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323– 339)Filtro cellulare GenScript
70uMBD352350
  30 uM Siringa Filcons SterileBD340598
AutoMacs ClassicMiltenyi Biotec130-088-887
GentamicinNormon624601.6
TranswellCostar3415
LBPronadisa1231
AgarPronadisa1800
Paraformaldeide 16%Microscopia elettronica Scienze15710
Triton X-100
CD8 biotBD Biosciences553029
IgM BiotImmunoStepClone RMM-1
B220 BiotBD Biosciences553086
CD19 biotBD Biosciences553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)BD Biosciences553622
CD11b biotImmunostep11BB-01mg
CD11c biotImmunostep11CB3-01mg
DX5 biotBD Biosciences553856
Gr-1 biotBD Biosciences553125
CD16/CD32ImmunoStepM16PU-05MG
anti SalmonellaABD Serotec8209-4006
CD11cPEBD Biosciences553802
CD4-APCTonbo Biosciences20-0041-U100
Gr-1 APCBD Biosciences553129
MHC-II (I-A/I-E) FITCBD Biosciences553623
Alexa-Fluor 647 Anticorpo IgG (H+L) di capra anti-coniglio,Invitrogenaltamente adsorbitoA-21245
CMAC (7-ammino-4-clorometilcumarina)Life technologiesC2110
BSASIGMAA7030-100G
Microsfere di streptavidinaMiltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD Biosciences

Riferimenti

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