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Articolo metodologico

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

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⸱

DOI:

10.3791/52978

⸱

18 agosto 2015

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Neurology, The Emory University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

I modelli di ictus tromboembolico sono strumenti vitali per ottimizzare la terapia di ricanalizzazione. Qui riportiamo un modello murino di ictus trombotico basato sull'insulto ipossico-ischemico cerebrale transitorio (tHI), che innesca trombosi e infarto e risponde favorevolmente alla fibrinolisi mediata dall'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) in una finestra terapeutica simile a quelle dei pazienti con ictus.

Abstract

Ricerca Stroke ha sopportato molte battute d'arresto nel tradurre terapie neuroprotettive nella pratica clinica. Al contrario, la terapia del mondo reale (tPA trombolisi) raramente produce benefici in modelli sperimentali meccanici basati occlusione-, che dominano la ricerca preclinica ictus. Questa scissione tra la panchina e comodini suggerisce la necessità di impiegare modelli tPA-reattiva nella ricerca preclinica ictus. A tal fine, un modello semplice e tPA-reattiva ictus trombotico è inventato e descritto qui. Questo modello si compone di occlusione transitoria dell'arteria carotide comune unilaterale e consegna del 7,5% di ossigeno attraverso una maschera in topi adulti per 30 minuti, mantenendo la temperatura rettale animale a 37,5 ± 0,5 ° C. Sebbene legatura reversibile della carotide unilaterale o ipossia ciascun soppressa flusso sanguigno cerebrale solo transitoriamente, la combinazione di entrambi insulti causato durata deficit riperfusione, fibrina e piastrine deposizione e grande Infarct nel territorio cerebrale mezzo dell'arteria fornito. Importante, coda vena iniezione di tPA ricombinante a 0,5, 1, o 4 ore post-THI (10 mg / kg) disponibile riduzione tempo-dipendente delle dimensioni mortalità e infarto. Questo nuovo modello di ictus è semplice e può essere standardizzata attraverso laboratori per confrontare i risultati sperimentali. Inoltre, induce trombosi senza craniectomy o introdurre emboli preformati. Alla luce di questi meriti unici, il modello THI è un'utile aggiunta al repertorio della ricerca preclinica ictus.

Introduzione

La trombolisi e ricanalizzazione è la più efficace terapia dell'ictus ischemico acuto nella pratica clinica 1. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche neuroprotezione preclinica è stata eseguita in un modello transitorio meccanico ostruzione (endoluminale sutura occlusione dell'arteria cerebrale media) che produce un rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione della occlusione vascolare e mostra poco o nessun benefici di tPA trombolisi. È stato suggerito che la scelta dubbia di modelli ictus contribuito, almeno in parte, alla difficoltà nel tradurre terapia neuroprotettiva ai pazienti 2,3. Quindi, vi è una crescente richiesta per l'impiego di modelli di ictus tromboembolico tPA-reattiva nella ricerca preclinica, ma tali modelli hanno anche problemi tecnici (vedi Discussione) 4-7. Qui si descrive un nuovo modello di ictus trombotico in base transitorio ipossico-ischemica (THI) insulto unilaterale e le sue risposte alla terapia endovenosa tPA 8.

Il modello di ictus THI è stato sviluppato sulla base della procedura di Levine (legatura permanente della carotide comune unilaterale seguita da esposizione ad ipossia transitoria in una camera), che è stato inventato per esperimenti con ratti adulti nel 1960 9. La procedura originale Levine caduta nell'oscurità perché ha prodotto solo danni al cervello variabile, ma lo stesso insulto causato neuropatologia coerente in cuccioli di roditori quando fu reintrodotta da Robert Vannucci e dai suoi colleghi come un modello di neonatale ipossico-ischemica encefalopatia (HIE) nel 1981 10. Negli ultimi anni, un po ' investigatori ri-adattato il modello Levine-Vannucci di topi adulti regolando la temperatura della camera ipossica 11. E 'plausibile che le lesioni cerebrali incoerenti nella procedura originale Levine possono derivare da sbalzi di temperatura del corpo dei roditori adulti nella camera ipossica. Per verificare questa ipotesi, abbiamo modificato la procedura di Levine con la somministrazione di gas ipossicoattraverso una maschera, mantenendo la temperatura al cuore roditore a 37 ° C sul tavolo operatorio 12. Come previsto, il controllo della temperatura corporea severi notevolmente aumentato la riproducibilità della patologia cerebrale HI-indotta. L'insulto HI innesca anche la coagulazione, l'autofagia, e grigi e lesioni 13 bianco-materia. Altri ricercatori hanno usato anche il modello HI a indagare post-ictus risposte infiammatorie 14.

Una caratteristica unica del modello ictus HI è che ricalca triade di Virchow di formazione di trombi, compresa la stasi del flusso di sangue, danno endoteliale (ad esempio a causa di stress ossidativo HI-indotta), e ipercoagulabilità (attivazione piastrinica HI-indotta) ( Figura 1A) 15. In quanto tale, il modello HI può catturare alcuni meccanismi fisiopatologici rilevanti per ictus ischemico del mondo reale. Con questa idea in mente, abbiamo perfezionato ulteriormente il modello HI con legatura reversibile delle Nazioni Uniteilateral carotide comune (quindi per creare un transitorio HI insulto), e testato le sue risposte a tPA trombolisi con o senza edaravone. Edaravone è un scavenger di radicali liberi già approvato in Giappone per il trattamento di ictus ischemico entro 24 ore di insorgenza 9. I nostri esperimenti hanno dimostrato che il più breve 30 minuti transitorio HI innesca infarto trombotico, e che il trattamento combinato tPA-edaravone conferisce benefici sinergici 8. Qui si descrivono le procedure chirurgiche dettagliate e considerazioni metodologiche del modello THI, che possono essere utilizzati per ottimizzare i trattamenti riperfusione di ictus ischemico acuto.

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Protocollo

Questo protocollo è approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della Emory University e segue il National Institutes of Health Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Setup

  1. Preparare il letto chirurgico su pad riscaldamento collegata con pompa di calore a 37 ° C per almeno 15 minuti prima della chirurgia. Posizionare un paranuca con il barile di 3 ml della siringa sul letto chirurgico. Preparare il gas anestesia con 2% isoflurano in aria medicale.
  2. Preparare pinze autoclavato, forbici, porta micro aghi, emostatico, tamponi di cotone e suture. Preparare colla tissutale e unguento oculare.
  3. Impostare il sistema ipossia e termoregolatori con lampada di riscaldamento e sonda rettale. Preparare gas ipossia con 2% isoflurano nel 7,5% O 2 equilibrato per il 92,5% di N 2.
  4. Un'ora prima dell'intervento chirurgico, i topi sono analgesized mediante iniezione sottocutanea di un lento rilascio Meloxicam (4.0 mg / kg).

2. Transient cerebrale ipossia-ischemia (Figura 1B)

  1. Anestetizzare 10-13 settimane di età C57BL maschio / 6 topi di peso 22-30 g nella camera di induzione dell'anestesia con il 3% isoflurano finché l'animale non risponde ai piedi stretta, e quindi rimuovere i peli sul collo a destra con un rasoio elettronico.
  2. Posizionare i mouse sul letto chirurgico legato 2% isoflurano in aria medicale a portata di 2 l / min. Arti anteriori Sicuro stese lungo paranuca ai lati con del nastro medico.
  3. Pulire il sito chirurgico per incisione con betadine seguito da alcol e poi tamponi di cotone.
  4. Sotto il microscopio dissezione, fare un'incisione a 0,5 centimetri destro del collo dell'utero con una pinza rette e un micro forbici circa 0,2 cm lateralmente dalla pelle linea mediana.
  5. Utilizzare un paio di belle pinze dentellate per separare la fascia e il tessuto per esporre la destra carotide comune (RCCA). Separare con cura il RCCA dal nervo vagale usando un paio di pinza sottile liscia.
  6. Live nodo due pretagliati 5-0 sutura di seta (rilasciabile) sul RCCA, e poi cucire la pelle utilizzando 4-0 Nylon monofilamento di sutura (Figura 1C).
  7. Applicare una pomata occhio su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  8. Trasferire rapidamente i topi al sistema ipossia e mettere il naso e la bocca in maschera facciale con 2% isoflurano in 7,5% O 2 a portata di 0.5-1 L / min per 30 min.
    1. Durante ipossia, utilizzare termoregolatori con lampade riscaldanti per controllare la temperatura rettale a 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorare la frequenza respiratoria a 80-120 respiri / min. Il mantenimento della temperatura corporea superiore a 37 ° C durante l'ipossia è importante creare infarto cerebrale coerente. Bassa frequenza respiratoria di solito accade dopo 20 min ipossia. Rimuovere la maschera facciale e consentire il normale alimentazione di aria se la frequenza respiratoria scende al di sotto di 40. Questo richiede 1-2 minuti e non conta nella durata ipossia 30 min.
  9. Dopo ipossia, trasferiretopi per un letto chirurgica e rilasciare i due punti di sutura da RCCA. Chiudere la ferita utilizzando colla tissutale e quindi tornare topi per gabbia. Escludere gli animali se entrambi due nodi vivi sono inaspettatamente rilasciati dopo ipossia.
  10. Monitorare i topi per 5-10 minuti per recuperare da ipossia e anestesia. Posizionare il cibo bagnata nella gabbia e restituirlo alla struttura di cura degli animali.
    Nota: Gli animali che presentano lievi a comportamenti circuitazione grave a 24 ore dopo Thi sono correlati con infrazione del cervello. La maggior parte degli animali con sintomi di sequestro muoiono prima della timepoint 24 ore dopo Thị.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Nota: Anche se questa non è una procedura essenziale del modello THI, un sistema di imaging contrasto bidimensionale speckle laser 16 può essere utilizzato per caratterizzare i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale (CBF) durante o dopo ipossia-ischemia transitoria. Per documentare le alterazioni del CBF sotto THI, registrare subito dopo la step 2.6. In alternativa, per confrontare recupero CBF dopo THI insulto, queste procedure possono essere eseguite dopo la fase 2.10.

  1. Inserire un topo anestetizzato in posizione prona ed eseguire da 1 cm a lunga incisione mediana sul cuoio capelluto con il cranio esposto, ma non aperto.
  2. Monitorare CBF in entrambi gli emisferi cerebrali sotto un imager flusso di sangue, secondo il protocollo del produttore e avviare la registrazione del flusso ematico cerebrale subito dopo l'intervento chirurgico CCAO (passo 2,6). Proseguire per 50 min.
  3. Mostra immagine CBF con unità arbitrarie in una tavolozza di 16 colori e analizzare in tempo reale le regioni selezionate utilizzando il software MoorFLPI seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2).
  4. Dopo aver registrato l'immagine CBF, chiudere il cuoio capelluto con colla tissutale e rispedire l'animale verso la gabbia.

Amministrazione 4. tPA

  1. Iniettare animali durante la vena della coda con il solvente o 10 mg / kg ricombinante tPA (220-300 &# 956; l di 1 mg / m tPA) a 0.5, 1 o 4 ore dopo tCCAo più ipossia (Figura 4).

5. Cervello rilevamento dei danni con diverse opzioni

Nota: Per raccogliere i campioni di cervello, eutanasia i topi a 1, 4 o 24 ore dopo Thị.

  1. Metodo Eseguire quantificazione del volume di infarto in vivo cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a 24 ore dopo THI insulto come descritto precedente. 17
    1. Intraperitoneale iniettare animali con 1,4 M soluzione di mannitolo (~ 0,1 ml / g di peso corporeo) 30 minuti prima di perfusione transcardial. Topi profumato transcardial con PBS seguita da 10 ml di 2% TTC.
    2. Rimuovere il cervello degli animali con strumenti chirurgici dopo 10 min e riporre in paraformaldeide 4% per la fissazione durante la notte e la sezione in spessore di 1 mm con un vibratome.
    3. Scatta una serie di quattro diapositive cervello sezionati al microscopio digitale e quantficare il volume dell'infarto come il rapporto tra l'area infartuata (area bianca sul lato destro) alla zona della integro, nell'emisfero controlaterale utilizzando il software ImageJ.
  2. In alternativa, effettuare la formazione di trombosi mediante immunofluorescenza a 1 ora dopo Thi insulto.
    1. Congelare il cervello fisso in OCT e la sezione del cervello a 12 micron di spessore con un criostato.
    2. Incubare il vetrino di cervello di coniglio con anticorpo anti-fibrinogeno (1: 100) in seguito da capra anti-coniglio Alexa fluo 488 dye (1: 200) per osservare la fluorescenza su un microscopio a fluorescenza.
  3. In alternativa, eseguire nave ostruzione da iniezione vena della coda di 100 ml 2% Evans colorante blu a 4 ore dopo Thị insulto.
    1. Euthanize i topi e rapidamente tagliare la testa per rimuovere cervelli in paraformaldeide al 4% dopo l'iniezione blu Evans. Nota: Ci vogliono 5-10 min per Evans blu circolazione con il colore blu sia anteriori e hind arti.
    2. Seziosu cervelli fissi a 100 micron di spessore con un microtomo scorrimento e osservare la fluorescenza usando un filtro di emissione 680 nm su un microscopio a fluorescenza.

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Risultati

Bidimensionale imaging a contrasto di speckle laser (LSCI) 16 è stato utilizzato per confrontare le alterazioni del flusso ematico cerebrale (CBF) per 30 min transitoria occlusione carotidea unilaterale (tCCAO), 30 minuti di esposizione ad ipossia (7,5% di ossigeno), e 30 min unilaterale carotidea legatura sotto ipossia (THI). Questo esperimento ha rivelato che tCCAO sotto normossia soppressa la CBF sulla carotide legatura emisfero ~ 50% del valore basale, che recuperato rapidamente al di sopra dell'85% d...

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Discussione

L'ictus è un problema di salute importante di crescente importanza per ogni società con un invecchiamento della popolazione. A livello globale, l'ictus è la seconda causa di morte, con una stima di 5,9 milioni di eventi fatali nel 2010, pari al 11,1% di tutti i decessi 18. L'ictus è anche la terza principale causa di anni di vita disability-adjusted (DALY) hanno perso a livello mondiale nel 2010, passando dalla quinta posizione nel 1990 19. Questi dati epidemiologici evidenziano la nece...

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Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione NIH NS074559 (a C. K.). Ringraziamo tutti i collaboratori che hanno contribuito ai nostri articoli di ricerca su cui si basa il presente rapporto metodologico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
topi maschi adultiCharles RiverC57BL/6 10-13 settimane (22-30 g)
Sistema mobile di anestesia per animali da laboratorioVetEquip901807per anestesia
Serbatoio d'aria medica (compresso)AirgasUN1002per anestesia
IsofluranoPiramal HealthcareNDC 66794-013-25per anestesia
anestesia animale da laboratorio multistazioneipossia
Surgivet V7035017,5% O2 bilanciato da 92,5% N2 serbatoioAirgasUN1956sistema di ipossia
Regolatore di temperatura con lampada riscaldante...Cole ParmerRegolatori di temperaturaEW-89000-10
Sonda rettaleCole ParmerNCI-00141PGregolatori
di temperatura Microscopio da dissezione Olimpo Impianto chirurgicoSZ40
Pompa di calore con termoforoGaymar Configurazione chirurgicaTP700
Pinza curva fine (seghettata)Strumento chirurgicoFST11370-31
Pinza curva fine (liscia)Strumento chirurgicoFST11373-12
micro forbiciStrumento chirurgicoFST15000-03
Portaaghi FST12060-01Strumento chirurgico
Halsted-Mosquito emostaticiFST13008-12strumento chirurgico
5-0 sutura di seta Harvard Apparatus624143forniture chirurgiche
Sutura monofilamento in nylon 4-0LOOK766Bforniture chirurgiche
Colla tissutaleAbbott LaboratoriesNC9855218forniture chirurgiche
Unguento veterinario PuralubeFisherNC0138063 prevenzione della secchezza oculare 
Imager del flusso sanguigno MoorFLPI-2Moor780-nmLaser Speckle Contrast Imaging
MannitolSigmaM4125in vivo TTC
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) SigmaT8877in vivo TTC
VibratomeStoelting51425sezione cerebrale per in vivo TTC 
Microscopio digitaleDino-LiteAM2111imaging dell'intero cervello
Composto OCTSakura Finetek4583
capra anti-coniglio Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Immunoistochimica
CriostatoVibratomoultrapro 5000sezione cerebrale per IHC
Evans blueSigmaE2129Rilevamento vascolare
perfusione Microtomo Microscopiaelettronica Scienze5000sezione cerebrale per istologia
Avertin (2, 2, 2-Tribromoetanolo)SigmaT48402eutanasia
Microscopio fluorescenteOlympusDP73
Meloxicam SRZooPharmanalgesia FANS
Sistema di Sistema di Sorgente laser

Riferimenti

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