L'esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Sommario

Le microglia possono influenzare i neuroni e altre gliali in coltura attraverso vari meccanismi autonomi non cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per esaurire selettivamente le microglia da colture neuronali primarie. Questo metodo ha il potenziale per chiarire il ruolo delle interazioni microgliali-neuronali, con implicazioni per le condizioni neurodegenerative in cui la neuroinfiammazione è una caratteristica distintiva.

Abstract

Le microglia, le cellule immunocompetenti residenti del SNC, svolgono un ruolo multiforme nella modulazione e nel controllo della funzione neuronale, oltre a mediare l'immunità innata. I modelli primari di colture cellulari di roditori hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle interazioni neuronali-gliali, ma solo di recente sono stati utilizzati metodi per eliminare specificamente la microglia da colture miste. Una di queste tecniche – qui descritta – è l'uso dell'estere metilico di L-leucina, un agente lisomotropo che viene internalizzato dai macrofagi e dalla microglia, in cui provoca l'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi^13,14. Gli esperimenti che utilizzano l'estere metilico di L-leucina hanno il potere di identificare il contributo della microglia all'ambiente cellulare circostante in diverse condizioni di coltura. Utilizzando un protocollo ottimizzato nel nostro laboratorio, descriviamo come eliminare la microglia dalla coltura cellulare di granuli cerebellari di roditori P5. Questo approccio consente di valutare l'impatto relativo delle microglia sui dati sperimentali, nonché di determinare se le microglia svolgono un ruolo neuroprotettivo o neurotossico nei modelli di coltura di condizioni neurologiche, come l'ictus, l'Alzheimer o il morbo di Parkinson.

Introduzione

Il cervello umano è composto una stima di 85 miliardi di neuroni e un ulteriore 85 miliardi di cellule non neuronali tra cui glia ^1. Per la maggior parte degli ultimi 100 anni i neuroscienziati si sono concentrati prevalentemente sulla popolazione delle cellule neuronali, cellule gliali credendo di essere poco più di cellule di supporto passivi che hanno fornito supporto strutturale per i neuroni - da qui l'etimologia greca del 'glia' tradotto in inglese come 'colla'. Recentemente, tuttavia, è diventato sempre più evidente che le interazioni neuronali gliali possono essere molto più fondamentale per aspetti fondamentali della neurobiologia, neurofisiologia, e la genesi e progressione di molte malattie neurodegenerative. Cellule cerebellari granulari (CGC), il più abbondante popolazione neuronale omogenea nel cervello umano, dominano il cervelletto e costituiscono oltre il 90% dei suoi componenti cellulari. Di conseguenza, queste cellule sono stati ampiamente utilizzati in vitro come sistema modello per tegli studio dello sviluppo neuronale, funzione e patologia ^2-6.

Tuttavia, le culture CGC contengono ancora microglia e glia altri in proporzioni probabilmente significativi. Di conseguenza, i dati che mostrano CGC putatively risposte neuronali scalo a trattamenti con le cellule differenti possono infatti insorgere - in tutto o in parte - dalla risposta secondario indiretta della vicina glia nella cultura. Per valutare questo, abbiamo selettivamente eliminato microglia da colture neuronali CGC con l'ausilio di estere metilico L-leucina (LME). LME è un agente lysomotropic originariamente utilizzato per distruggere selettivamente macrofagi ^7, e da allora è stato usato per esaurire anche selettivamente microglia da neurale, astrociti, e le culture gliali miste ^8,9,10. LME è interiorizzato da macrofagi e microglia, in cui esso provoca un'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi ^13,14. Macrofagi e microglia sono caratteristicamente ricchi di lisosomi, causando loro di essere particularly vulnerabile in seguito all'esposizione al trattamento LME. Questo protocollo fornisce un modo potente, ma semplice e facile stabilire il contributo della microglia in esperimenti utilizzando altri sistemi di coltura gliali / neuronali CGC e.

Protocollo

Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle Regno Unito Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986.

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Preparare due forbici laboratorio in acciaio inox di dissezione e due pinze da laboratorio in acciaio inox. Autoclavare tutti gli strumenti e posto in una cappa di coltura O / N sotto luce (UV) ultravioletta per la sterilizzazione.
2. Fate 500 ml di mezzi essenziali (MEM) terreno minimo cultura (10% fetale Bovine Serum [FBS], 20 mM KCl, 25 NaHCO mm _3, 30 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 6 mg / ml di ampicillina) e filtro sterilizzare. Conservare a 4 ° C per mesi.
3. Preparare 24 piastre di coltura e contenenti 14 mm, numero 1 coprioggetto spessore. Autoclave i coprioggetti e cappotto a 100 mg / L poli-d-lisina (PDL) come descritto in precedenza ^3. Luce UV sterilizzare O / N.

2. Preparazione di CGC Cultura Solutions

1. Preparare 'soluzione A' (100 ml) in autoclave, luce UV trattato, dH ₂ O sterile contiene 250 mg di glucosio, 300 mg di albumina sierica bovina [ASC], 955 mg di tampone fosfato [PBS] (Ca ²⁺ e Mg ⁺ free), e 1 ml di 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O.
2. Preparare 'soluzione B' (10 ml) contenente 1 ml di 5 mg / ml di tripsina diluito in 9 ml di soluzione A.
3. Preparare 'soluzione C' (10 ml) contenente 1.000 unità DNasi, 0,5 mg di inibitore della tripsina di soia, 100 ml di 3,8% _MgSO4 · 7H ₂ O, diluita a 10 ml con soluzione A.
4. Preparare 'soluzione D' (20 ml) contenente 3,2 ml di soluzione C, diluita a 20 ml con soluzione A.
5. Preparare la soluzione BSA / Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) contenente EBSS, 25 NaHCO mm _3, 3 MgSO mm ₄ · 7H ₂ O, e4% BSA, pH 7,4, come precedentemente descritto ^3.
6. Preparare LME aggiungendo puro LME in 5 ml di terreno di coltura MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME, riportare la soluzione a pH 7,4 utilizzando un pHmetro da banco, e filtro sterilizzare utilizzando un polietere solfone 28 mm (PES) 0,2 micron siringa filtro.

3. La coltura le CGC

1. Raccogliere cerebella 4-7 giorni vecchi cuccioli di ratto come descritto in precedenza ^3. Mettere subito in piastra Petri contenente 5 ml di soluzione A su ghiaccio.
2. Eliminare la soluzione in eccesso da cerebella e luogo del tessuto nel coperchio piastra di Petri.
3. Tagliare il tessuto finemente con una lama di rasoio ben fiammato-in almeno tre diverse direzioni.
4. Aggiungi il tessuto tagliato a soluzione B (lavare capsula di Petri con una soluzione per garantire il tessuto limitata è perso), e posto in bagno d'acqua a 37 ° C per 5 minuti. Agitare delicatamente ogni paio di minuti.
5. Aggiungere la soluzione D (20 ml) al tubo di neutralizzare la tripsina, scossa e centrifuge a 65 xg per 5 min.
6. Eliminare il surnatante.
7. Risospendere in 4 ml di soluzione C. Triturare anche (circa 10 volte ciascuna) con tre pipette di vetro fiammati di diametro decrescente, fino a quando la sospensione è più possibile uniforme.
8. Lentamente e delicatamente aggiungere qualche goccia di questo omogenato in cima alla BSA / EBSS. Se inizia ad affondare attraverso la BSA / EBSS, triturare più e / o aggiungere un po 'di soluzione più C. L'omogeneizzato dovrebbe sedersi in uno strato sopra l'BSA / EBSS. Non agitare. Spin a 100 g per 5 min.
9. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet (soft) in 1 ml di MEM.
10. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra a 800.000 cellule / vetrino in 500 ml di MEM. Inserire in termostato a 37 ° C con il 6% di CO _2.
11. Cambiare il medio il giorno seguente (24-36 ore dopo la preparazione). Fare una soluzione di MEM contenente 10 mM del ciclo cellulare inibitore arabinofuranosil citidina (AraC).
    1. Per ciascunovetrino, conservano 250 microlitri del vecchio medium in 24 pozzetti fresco, aspirare il resto, aggiungere 250 ml di normale media MEM e aspirare questo per lavare le cellule, poi aggiungete 250 ml di vecchio schienale medio alle cellule e rabboccare con 250 ml di medio-AraC contenenti.
       Nota: Le celle possono essere utilizzati da 6 giorni in vitro (DIV).

4. selettivamente L'esaurimento della microglia (eseguiti a 6 DIV)

1. Aggiungere LME puro a 5 ml di un'aliquota separata di MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME.
2. Riportare la soluzione a pH 7,4 e filtro sterilizzare con un solfone polietere 28 mm (PSE) filtro da 0,2 micron siringa.
3. Diluire soluzione ad una concentrazione di 50 mM (2 x LME) in terreno MEM e posto in un bagno d'acqua a ³⁷ ° C per 10 min con mezzo normale MEM per colture di controllo.
4. Rimuovere la metà (250 ml) il terreno MEM dalle culture CGC e mantenere a 37 ° C.
5. Cellule Treatcon MEM terreno contenente 2 x LME (250 microlitri), cioè diluito 1: 1 dando una concentrazione di ben 25 mM, o con pre-riscaldato mezzo MEM senza LME (250 microlitri) per colture di controllo.
6. Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con il 6% di CO ₂ per 1 ora.
7. Lavare le cellule due volte a fresco preriscaldato medio MEM per rimuovere LME contenenti supporti, e quindi sostituire il terreno di coltura conservato e un uguale volume di fresco pre-riscaldato medio MEM per rispettivi pozzetti.
8. Culture Ritorna alla incubatrice (inumidito con 6% di CO ₂ a 37 ° C) e lasciare riposare per 24 ore prima di ogni ulteriore trattamento.

Risultati

La capacità di questa tecnica per eliminare selettivamente microglia da CGC e / o colture miste si basa sulla successiva capacità del ricercatore di identificare accuratamente e differenziare microglia dalle celle circostanti. Ciò può essere ottenuto usando una macchina per cella specifica-microglia, come isolectin-B4, come illustrato in figura 1. Come mostrato nella Figura 2, nessun cambiamento osservabile astrociti e la densità neuronale e morfologia sono stati registrati con riferime...

Discussione

I passi più importanti per assicurare l'eliminazione selettiva di successo di microglia da CGC e / o colture miste sono: 1) il mantenimento di una cultura CGC sterile e sano; 2) filtro sterilizzante medio LME contenente e ritornando la soluzione a pH 7,4; 3) mantenere i media CGC conservati e LME contenenti supporti a 37 ° C per evitare lo shock termico; e 4) che lavorano rapidamente per ridurre il tempo di cellule sono tenuti all'esterno dell'incubatrice.

Abbiamo us...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze	Sigma-Aldrich	F4142	L'estremità curva facilita la rimozione del cervelletto
Forbici per micro-dissezione	Sigma-Aldrich	S3146	La punta diritta e affilata facilita la dissezione del roditore P4-7
L-leucina metil estere cloridrato	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS soluzione	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coprioggetti 1 giorno prima dell'uso
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNasi	Sigma-Aldrich	D5025
Inibitore della tripsina di soia	Sigma-Aldrich	T6414
Anticorpo anti-ED1 per topo	Abcam	ab31630