Kupffer isolamento delle cellule di nanoparticelle test di tossicità

Summary

I macrofagi epatici, chiamati cellule di Kupffer, sono responsabili della cattura delle nanoparticelle circolanti. Descriviamo qui un metodo, di elevata purezza e resa cellulare, per l'isolamento cellulare di Kupffer. Il test LDH modificato viene utilizzato qui per misurare la tossicità indotta dai nanotubi di carbonio nelle celle di Kupffer.

Abstract

La grande maggioranza degli studi in vitro nanotoxicological hanno utilizzato linee di cellule immortali per la loro praticità. Tuttavia, i risultati di test di tossicità delle nanoparticelle in linee cellulari immortali o cellule primarie hanno mostrato discrepanze, evidenziando la necessità di estendere l'uso di pile per saggi in vitro. Questo protocollo descrive l'isolamento di macrofagi fegato di topo, cellule di Kupffer denominate e il loro uso per studiare la tossicità delle nanoparticelle. Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e costituiscono parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), responsabile per la cattura di nanoparticelle circolanti. Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo, basato sulla digestione collagenasi e centrifugazione densità, è adattato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. Ideato per ratto isolatio cellule del fegaton e fornisce ad alto rendimento (fino a 14 x 10 ⁶ cellule per topo) e purezza elevata (> 95%) di cellule di Kupffer. Questo metodo di isolamento non richiede attrezzature sofisticate o costose e rappresenta quindi un compromesso ideale tra complessità e la resa delle cellule. L'uso di topi più pesanti (35-45 g) migliora la resa del metodo di isolamento, ma anche facilita notevolmente la procedura di cannulazione vena porta. La tossicità dei nanotubi di carbonio funzionalizzati f -CNTs stata misurata in questo modello con il saggio LDH modificato. Questo metodo valuta vitalità cellulare misurando la mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare Kupffer, dopo incubazione con -CNTs f. La tossicità indotta da -CNTs f può essere misurato in modo coerente da questo test, evidenziando che le cellule di Kupffer isolate sono utili per i test di tossicità delle nanoparticelle. La comprensione globale di nanotossicologia potrebbe beneficiare di tali modelli, rendendo la selezione nanoparticelle per traduzione clinica più efficiente.

Introduction

Il campo di ricerca nanotossicologia mira a caratterizzare l'effetto biologico delle nanoparticelle. Studi tossicologici basati su indagini in vivo restano i metodi più accurati. Tuttavia, il loro impiego è limitato dalla loro costo, lavoro e tempo requisiti ^1. Come saggi alternative, in vitro sono stati utilizzati per la loro semplicità e la possibilità di sviluppare ad alta produttività in piattaforme di test in vitro ² - così estendendo il numero di condizioni testate. La maggior parte degli studi nanotoxicological sono eseguiti utilizzando in vitro con linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, ci sono preoccupazioni per quanto riguarda l'estrapolazione di questi risultati sperimentali di effetti tossicologici in vivo ^3. Infatti, le proprietà di linee cellulari immortalizzate possono essere significativamente diverso dai tessuti sono stati derivati ​​da, per esempio la trasformazione genetica ^4, il deterioramento delle caratteristiche morfologiche chiave5, perdita della polarità cellulare ⁶ e alterazioni funzionali come la regolamentazione dei mediatori infiammatori ^7.

Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e sono direttamente in contatto con il sangue allineando la parete di sinusoidi epatici. Come parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), questi macrofagi sono responsabili per la cattura di circolazione nanoparticelle e pertanto costituiscono un modello particolarmente adatto per studiare la tossicità delle nanoparticelle. In vivo ⁸ e in vitro ⁹ studi di risposte infiammatorie associate con le cellule di Kupffer esposte a nanoparticelle sono stati pubblicati altrove. Cellule di Kupffer sono state coinvolte nella patogenesi delle malattie del fegato, come la malattia epatica alcolica ^10, fibrosi epatica ¹¹ o epatite virale ^12. E 'stato riferito che le cellule di Kupffer isolate forniscono informazioni utili per descrivere i meccanismi cellulari involved in rottura di fegato ^13,14.

Diversi metodi sono stati segnalati per isolare e purificare le cellule di Kupffer. Isolamento cellulare può derivare da meccanico o enzimatica dissociazione ^15. Digestione Collagenase mostra il vantaggio di conservare l'integrità funzionale delle cellule di Kupffer, mentre portando a rendimento cellula di alta Kupffer ^16. Molti approcci sperimentali, che variano in complessità e costi, sono stati utilizzati per separare le cellule di Kupffer da altre popolazioni cellulari del fegato. Ad esempio, la purezza delle cellule Kupffer può essere ottenuto mediante immunoaffinità ^17, elettroforesi flusso ^18, adesione selettiva ¹⁶ o mediante tecniche centrifughe ^16, che selezionano celle in base alla loro dimensione e la densità. Una combinazione di questi metodi può essere scelto per aumentare la purezza della popolazione ^16. Non c'è consenso sul metodo ideale per l'isolamento delle cellule Kupffer, in quanto dipende in gran parte l'applicazione e disponibili equipment. Tuttavia, nel caso di test di tossicità delle nanoparticelle, la semplicità e l'alta resa della tecnica associata con la conservazione funzionale delle cellule di Kupffer sembrava essere più adatto per questa applicazione.

Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo è stato modificato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. ¹⁶ progettato per l'isolamento delle cellule di fegato di ratto. La maggior parte degli studi hanno riportato e descritto l'isolamento delle cellule Kupffer da fegati di ratto. Qui, si descrive un metodo per isolare le cellule di Kupffer da fegato di topo, ad un alto rendimento e purezza. L'utilizzo di topi riduce il costo dell'esperimento e permette la lavorazione di diversi fegati di ottenere grandi quantità di cellule di Kupffer per test di tossicità nanoparticelle.

Nella seguente protocollo, cellule di Kupffer sono state incubate con nanotubi di carbonio funzionalizzati (f -CNTs). Le proprietà uniche chimico-fisiche del CNT - cioè alto rapporto lunghezza su diametro e grande superficie, hanno fatto CNT candidati interessanti come vettori per scopi terapeutici e di diagnosi. Tuttavia, sono state espresse in merito alla tossicità del CNT ^19, e lo sviluppo di nuovi test in vitro è inteso a migliorare la comprensione di CNT effetto biologico. Tossicità in cellule di Kupffer è associato ad una mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare. Questo viene misurato dalla perdita di enzima LDH citoplasmatica dalla cellula nel supernatante. Il principio di questo metodo, quindi, è quello di rimuovere qualsiasi LDH rilasciata e misurare ciò che resta nelle celle ^20. Questo viene fatto in preferenza alla misura della LDH rilasciata nel supernatante perché la presenza di CNT nel surnatante interferisce con il test ^21.

Proponiamo l'uso di questo efficace metho isolamento delle cellule Kupffer semplice ed economicod isolare elevato numero di cellule di Kupffer funzionali. Questo permette la proiezione di tossicità di una gamma di nanoparticelle, in un modello rilevante macrofagi primari.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Il protocollo di essere dimostrato è stata eseguita sotto la guida e l'approvazione del regolamento dell'ufficio IT Home

1. perfusione e Cell Collection (Figura 1)

Figura 1:. Fegato perfusione Dopo anestesia del mouse, il tratto digerente è lateralmente spostato a sinistra dell'addome in modo da rendere la vena porta (PV) accessibile. Il PV è cannulata con una bassa velocità di flusso (1-3 ml / min) della soluzione EGTA / HBSS e Veina cava inferiore (IVC) è immediatamente rotto per evitare qualsiasi eccesso di pressione all'interno del fegato. Entro il primo minuto di perfusione, la portata viene gradualmente aumentata a 7 ml / min. La soluzione di collagenasi viene perfuso a 10 ml / min fino a raggiungere la sua piena digestione.

1. Prepari appena tutti i reagenti descritti nella tabella materiale.
2. Scaldare il EGTA (glicole etilenico Tetra-acetico) / HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Solution (50 ml per mouse) e la soluzione di collagenasi (100 ml per il mouse) per 30 minuti a 40 ° C.
3. Sciacquare il tubo flessibile della pompa prima con il 70% di etanolo. Versare 40 ml di EGTA / HBSS soluzione in un tubo da centrifuga immerso nel bagno di acqua e risciacquare il tubo flessibile della pompa con pre-riscaldato EGTA / HBSS soluzione.
4. Eseguire anestesia terminale utilizzando un barbiturico per produrre in modo affidabile di incoscienza prima depressione respiratoria e morte. Iniettare phenobarbitone a 1 mg / kg, ip in un topo CD1 femminile o maschile (35-45 g). Confermare l'anestesia da pizzicare punta.
5. Shave peli addominali e sterilizzare la superficie addominale utilizzando una soluzione di etanolo al 70%.
6. Tagliare attraverso la cavità addominale ed esporre la vena porta e la vena cava inferiore spostando l'intestino lateralmente a sinistra dell'addome.
7. Stellat la pompa ad una velocità di 1-3 ml / min con la soluzione EGTA / HBSS e cannulate la vena porta con un ago 23 g farfalla (ali tagliate). Fissare la sezione della vena porta cannulata con l'ago 23 G e quindi capovolgere la pinza serrefine sulla superficie dell'addome del mouse aperto. Il fegato dovrebbe rapidamente pallido entro i primi 30 secondi di EGTA / HBSS soluzione perfusione.
8. Rapidamente incidere la parte inferiore della vena cava inferiore per evitare edificio sovrappressione nel fegato, e quindi aumentare la portata gradualmente a 7 ​​ml / min, il primo minuto di perfusione. L'animale muore a causa di sanguinamento secondario a Vena prelievo venoso cavale.
9. Quando meno di 5 ml di EGTA / HBSS soluzione è rimanente in provetta, riempire con collagenasi Solution (40-50 ml). Aumentare la portata gradualmente a 10 ml / min, più di 30 sec.
10. Rendere il rigonfiamento del fegato applicando pressione alla vena cava inferiore, utilizzando una pinzetta, per 5-10 intervalli sec. This può essere fatto periodicamente (5-10 volte durante la digestione). Questa fase permetterà di migliorare la dissociazione delle cellule del fegato e ridurre il tempo di perfusione con collagenasi.
11. Quando meno di 10 ml di soluzione di Collagenasi rimane all'interno del tubo da centrifuga, versare 40-50 ml di soluzione pre-riscaldato Collagenase nel tubo da centrifuga.
12. Dopo 10-15 minuti di perfusione e circa 70-80 ml di collagenasi Solution perfusi, applicare una piccola pressione sulla superficie del fegato con una pinza. Una stampa di pressione indica che le cellule epatiche sono dissociate.
13. Rimuovere il fegato dalla cavità addominale come un unico pezzo e metterlo in una provetta da centrifuga contenente 20-30 ml di Kupffer celle d'isolamento medio. Mantenere cellule epatiche in ghiaccio oa 4 ° C per un periodo massimo di 3 ore per evitare di compromettere la vitalità delle cellule del fegato.
14. Ripetere la procedura di perfusione su diversi animali, se necessario, mantenendo il fegato perfuso su ghiaccio. Pool 1-3 fegati per la purificazione e procedere con la fase 3.

2. Preparazione del gradiente di densità per centrifugazione (Figura 2)

Figura 2:. Preparazione del gradiente di densità Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. Il SIP è preparata mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestite con 1,7 ml di 10 x PBS. A 5 ml di SIP sono mescolati con 15 ml di PBS per rendere soluzione SIP 20 ml di 25%. 10 ml di SIP sono mescolati con 10 ml di PBS per ottenere soluzione SIP 20 ml di 50%. Un tubo da centrifuga contenente la soluzione al 50% SIP (20 ml) è inclinato e la soluzione SIP 25% (20 ml) viene aggiunta lentamente utilizzando un ml pipetta sierologica 25.

1. Procedere con le seguenti operazioni (sezione 2., 3. e 5.) sotto condizioni sterili e mantenere le cellule in ghiaccio o a 4 ° C. Preparare la SIP (Soluzione di particelle di silice rivestite Isotonic) mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestiti con 1,7 ml di 10 x PBS.
Per rendere 20 ml di soluzione SIP 25%, mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di PBS. Per rendere 20 ml di soluzione SIP 50%, miscelare 10 ml di SIP con 10 ml di PBS.
2. Riempire una provetta da centrifuga con 20 ml della soluzione SIP 50%. Inclinare la provetta da centrifuga con un angolo vicino a 90 ° e aggiungere lentamente la soluzione SIP 25% (20 ml) sulla parete laterale del tubo con un 25 ml pipetta sierologica, senza toccare la superficie dello strato SIP 50%. Quando si aggiunge la soluzione SIP 25%, ridurre progressivamente l'angolo del tubo. Mantenere il gradiente di densità su ghiaccio fino al momento dell'uso.

3. Kupffer Purificazione cellulare (Figura 3)

Figura 3:. Purificazione di cellule di Kupffer dal gradiente di densità centrifugazione e l'adesione cellulare Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. (A) Dopo la rottura della capsula di Glisson, cellule del fegato sono filtrate attraverso un 100 micron filtro. La sospensione è centrifugato a x 50 g di disfarsi epatociti (pellet) e raccogliere la frazione di cellule non parenchimali (surnatante). Questa fase viene ripetuta 3 volte. Le cellule non parenchimali vengono aggiunti in cima a un gradiente isotonica discontinuo e centrifugato a 800 xg per 15 min. Cellule di Kupffer raccolti dal cuscino SIP 25% sono purificati ulteriormente selezione adesione cellulare. (B) Le cellule vengono piastrate in piastra da 24 pozzetti e incubate a 37 ° C e 5% CO ₂ per 30 min. Le cellule non aderenti vengono lavati una volta con 500 ml di HBSS. Cellule di Kupffer mostrano la loro aderenti morfologia 4 ore dopo la placcatura, quando -CNTs f possono essere aggiunti alle cellule. La barra della scala rappresenta il 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Mettere un fegato perfuso in una capsula di Petri con 15 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium. Rottura capsula di Glisson (membrana del fegato) con le forbici e rilasciare tutte le cellule del fegato nel mezzo di isolamento delle cellule Kupffer. Filtrare la soluzione se un filtro cellulare 100 micron per essere raccolto in una provetta da centrifuga. Ripetere la procedura di perfusione su altri fegati irrorati e riunire le celle nella stessa provetta da centrifuga (15 ml di un mouse, fino a 45 ml da tre topi).
2. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Cellule parenchimali (epatociti) saranno in pellet e cellule non parenchimali (comprese le cellule di Kupffer) saranno nel surnatante.
3. Raccogliere il supernatante in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare a 50 xg per 2 minuti ciascuno. Ripetere questa operazione per altre tre volte.
4. Centrifugare a 1.350 xg per 15 minuti per far sedimentare le cellule non parenchimali. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium.
5. Aggiungere la soluzione di cellule non parenchimali sul gradiente discontinuo isotonica 25/50% come descritto al punto 2.3. Centesimorifuge a 850 xg per 15 minuti, senza accelerazione o interruzione.
6. Localizzare la frazione di cellule di Kupffer arricchita torbidi all'interno della frazione SIP 25% vicino all'interfaccia SIP 25/50% (Figura 3). Utilizzando un 10 ml pipetta sierologica, aspirare circa 12 ml di frazione di cellule Kupffer arricchito. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga contenente 35-40 ml di Kupffer isolamento delle cellule Media. Miscelare delicatamente e centrifugare a 1.350 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le cellule.
7. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 5-10 ml di pre-riscaldato cellule Kupffer Cultura Media. Contare le celle (emocitometro) e misurare la sostenibilità utilizzando trypan colorazione blu.
8. Piastra le purificate cellule non parenchimali in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 5 x 10 ⁵ cellule / pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO ₂ (Figura 3). Dopo 30 minuti, togliere delicatamente il medium, lavare con pre-riscaldato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) una volta quindi sostituirecon 500 ml di fresco e pre-riscaldato Kupffer terreno di coltura cellulare (per bene).
9. Lasciare cellule di Kupffer per almeno 4 ore a 37 ° C e 5% CO ₂ prima del trattamento con nanoparticelle, per consentire loro di acquisire loro morfologia aderente.

4. Caratterizzazione

1. Kupffer Cells Purezza
   1. Preparare fresco soluzione PBS / BSA utilizzato per mantenere la vitalità delle cellule Kupffer. Lavare le cellule una volta con 500 ml di soluzione di PBS / BSA. Rimuovere la soluzione PBS / BSA e staccare cellule di Kupffer in 500 ml di soluzione fresca PBS / BSA con delicato raschiatura. Quando le cellule vengono piastrate in piastre da 24 pozzetti, abbreviare le estremità delle pale raschianti con forbici per rendere il distacco facile procedere. Trasferire le cellule in citometria a flusso tubi.
   2. Contare le cellule di Kupffer utilizzando un emocitometro e centrifugare 1 x 10 ⁵ cellule a 1.350 x g. Risospendere le cellule Kupffer in 30 ml di F4 / 80 anticorpi (pulito). Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Mantenere le cellule non colorate (non incubate con l'anticorpo) su ghiaccio.
   3. Aggiungere 2 ml di soluzione PBS / BSA in cellule colorate, centrifugare a 1.350 g per 5 minuti e scartare il surnatante risultante. Risospendere cellule colorate in 200 ml di PBS / BSA.
   4. Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-1 canale.
   5. Ripetere la procedura per le cellule di Kupffer colorate mantenendo le stesse impostazioni utilizzate per l'analisi di citometria a flusso di cellule di Kupffer non colorati. Selezionare e quantificare la fluorescenza delle cellule colorate per valutare la purezza delle cellule Kupffer.
2. Kupffer cellulare fagocitaria Attività
   1. Sostituire media con 0,5% (v / v) perline fluorescenti in Kupffer cellulare terreno di coltura e incubare per 4 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
   2. Al fine di rimuovere perline non interiorizzate, cellule di Kupffer centrifugare a 1.350 xg, discard le cellule surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS / BSA Solution. Ripetere questa operazione altre 2 volte.
   3. Raschiare le cellule Kupffer in 500 ml di soluzione e di trasferimento cellule PBS / BSA in un tubo di citometria a flusso.
   4. Cellule centrifuga Kupffer a 1.350 xg, scartare le cellule surnatante e risospendere in 200 ml di PBS / BSA Solution.
   5. Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-2 canali.

5. Incubazione di chimicamente nanotubi di carbonio funzionalizzati (f -CNTs)

1. Preparare una dispersione di -CNTs f (1 mg / ml) in acqua mediante sonicazione per 15 minuti prima dell'uso. -CNTs F sono preparati in casa ^22.
2. Preparare 2x CNT f- concentrati dispersione in Kupffer terreno di coltura cellulare. CNT f- Sonicare dispersi in mezzo per2 min prima di procedere con passo 5.3).
3. Per ogni bene, sostituire 250 ml di vecchi media con 250 ml di 2x dispersione -CNTs f. Pozzetti non trattati (250 l di media condizionata + 250 ml di fresco Kupffer terreno di coltura cellulare) e pozzi trattati con 10% di DMSO sono utilizzati come controlli negativi e positivi, rispettivamente.
4. Incubare le cellule di Kupffer a 37 ° C e 5% CO ₂ per 24 o 72 ore.

6. Tossicità Valutazione della -CNTs f in cellule di Kupffer dal lattato deidrogenasi (LDH) Modificato

1. Scartare il surnatante.
2. Aggiungere 200 microlitri (per pozzetto della piastra da 24 pozzetti) di tampone di lisi e incubare a 37 ° C per 30 min-1 hr.
3. Dopo aver effettuato pipettaggio vigoroso, raccolgono lisate cellule di Kupffer in provette da microcentrifuga e centrifugare a 40.000 g per 10 minuti a pellet -CNTs f che sono state prese dalle cellule e detriti cellulari.
4. Raccogliere il surnatante (ƒ-CNT gratis) inprovette da microcentrifuga e conservare a -20 ° C o passare al punto 6.5).
5. Trasferire 50 ml in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere un volume uguale di soluzione di substrato mix (kit LDH) a ciascun pozzetto. Coprire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 15 min prima di aggiungere 50 ml di soluzione di arresto (kit LDH). Aggiungere triplicato di pozzi vuoti contenenti 50 ml di tampone di lisi, 50 ml di soluzione di substrato mix e 50 ml di soluzione di stop.
6. Leggere l'assorbanza a 490 nm in un lettore per micropiastre e utilizzare la seguente formula per calcolare il (%) vitalità cellulare.

Results

Il numero di cellule parenchimali non purificati era coerente e variava tra 8 e 14 x 10 ⁶ cellule per topo (sono stati eseguiti 17 isolamenti). Ogni isolamento topo era sufficiente alla piastra 16-28 pozzi. La vitalità cellulare da trypan colorazione blu ha dimostrato la vitalità delle cellule ~ 95%. Cellule di Kupffer mostrato una forma rotonda in 30 min di incubazione a 37 ° C, in relazione alla loro morfologia incomplete aderente (Figura 4A). A 4 ore di incubazione e successivamente, le ce...

Discussion

I seguenti punti sono fondamentali per conseguire un livello elevato rendimento e l'alta vitalità delle cellule di Kupffer. Condizioni asettiche dovrebbero essere utilizzati per limitare il rischio di contaminazione batterica e fungina. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima dell'uso. I reagenti devono essere preparate al momento, prima di effettuare la procedura di isolamento.

La scelta di collagenasi IV, con bassa attività trittico, è di fondamentale importanza. Diver...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euthatal (pentobarbital sodico)	Topi Merial
CD1	Charles River	-	Il peso del mouse dovrebbe variare da 35 a 45 g. Consigliamo l'uso di topi CD1 maschi poiché il loro peso aumenta rapidamente (es un topo CD1 maschio di 7 settimane supera i 35 g di peso). Si consiglia inoltre di contattare in anticipo il fornitore dell'animale per organizzare la consegna degli animali più anziani. In alternativa, gli animali possono essere in casa per raggiungere il peso desiderato.
HBSS (Ca2+ e Mg2+ free, con bicarbonato)	Tecnologie per la vita	14175-053	HBSS deve essere Ca2+ gratuito.
Sale tetrasodico dell'acido tetraacetico glicole etilenico (EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	L'EDTA può anche essere utilizzato, ma l'EGTA ha il vantaggio di chelare Ca2+ selettivamente.
HEPES (1 M)	Tecnologie per la vita	15630-056	100 ml
Collagenasi di tipo IV	Worthington	CSL-4	Si consiglia di testare diversi lotti di collagenasi o almeno di menzionare al fornitore che il prodotto deve essere adatto all'isolamento delle cellule epatiche.
DMEM a basso contenuto di glucosio	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (con piruvato di sodio e glutamax)	Tecnologie per la vita	Codice 12633-012	Flacone da 500 ml
Penicillina/Steptomicina	Tecnologie per la vita	15140-122	100 ml
di siero fetale bovino	Primo collegamento	60-00-850	500 ml
Soluzione blu di tripano	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Soluzione di particelle di silice rivestita (Percoll)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll è molto stabile e può essere conservato per diversi anni.
1x soluzione salina tamponata con fosfato	Tecnologie per la vita	10010-023	500 ml
10x soluzione salina tamponata con fosfato	Tecnologie per la vita	70011-036	500 ml
di dimetilsolfossido	Pescatore	D/4120/PB08	500 ml
Kit LDH (CytoTox 96)	Promega	G1781	Proteggiti dalla luce
DMEM rosso fenolo libero	Life Technologies	31053-028	500 ml
Anticorpo F4/80 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Non diluire, utilizzato puro per la citometria a flusso
Perle fluorescenti	Sigma	L2778	Perle di lattice, polistirene modificato con ammina, rosso fluorescente. 1 ml
Nome del materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti/Descrizione
Set per la raccolta del sangue a farfalla (tubo lungo 23 G/305 mm)	BD
Filtri per siringhe (0,22 & mu; m Orlo blu)	Minisart	16534-K
Provette da centrifuga (tappo blu da 50 ml)	BD Bioscienze, Falco	35 2070
Piastra di Petri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μ filtro cellulare m	BD	352360
Pompa peristaltica	Watson Marlow	SciQ 300	Sciacquare i tubi prima e dopo ogni utilizzo con PBS sterile ed etanolo al 70%.
Piastre a 24 pozzetti	Corning	3526
piastre a 96 pozzetti	Corning	3595
Centrifuga	Eppendorf	5810R
Lettore di piastre	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine pinza	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	La pinza serrefine consente di bloccare il vaso cannulato con l'ago da 23 G senza la necessità di impugnare la pinza durante la procedura di perfusione. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Provette per citometria a flusso	BD Biosciences, Falcon
Provette per microcentrifuga (1,5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Raschietto cellulare	BD Biosciences, Falcon	353086	Tagliare le estremità della lama con un paio di forbici per raschiare le cellule in piastre a 24 pozzetti.
Nome della società di reagenti		Numero di catalogo	Commenti/Descrizione
Soluzione EGTA (acido etilenglicole tetraacetico)/HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank)			HBSS contenente 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4. Preparare 50 ml per ogni fegato da perfondere.
Soluzione di collagenasi			DMEM a basso contenuto di glucosio contenente collagenasi di tipo IV a 100 UI/ml, 15 mM HEPES e 1% Penicillina/Streptamicina (v/v). Regolare il pH a 7,4. Preparare 100 ml per ogni fegato da perfondere. Dopo aver aggiunto la collagenasi, si consiglia di riscaldare la soluzione per 30 minuti prima dell'uso. Ciò consente all'attività della collagenasi di essere ottimale.
Terreno di isolamento cellulare Kupffer			RPMI contenente, 1% di aminoacidi non essenziali (v/v), 1% di glutamax. (v/v) e 1% penicillina/streptomicina (v/v). Preparare almeno 100 ml per 1-3 fegati.
Terreno di coltura cellulare Kupffer			RPMI contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di aminoacidi non essenziali (v/v), l'1% di glutamax (v/v) e 1% penicillina/streptamicina (v/v). Preparare almeno 100 ml per 1-3 fegati.
SIP (soluzione di particelle di silice rivestite isotoniche)			Mescolare 1,7 ml di 10x soluzione salina tamponata con fosfato con 15,3 ml di Percoll per ottenere 17 ml di SIP.
Soluzione SIP al 25%			Mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato
Soluzione SIP al 50%			Mescolare 10 ml di SIP con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato
Tampone			DMEM con soluzione
		PBS/BSA	Preparare una soluzione salina tamponata con fosfato fresco pH 7,4 con albumina sierica bovina all'1%.