Questo articolo dimostra procedure chirurgiche di reflusso gastroesofageo con topi. Questi modelli sono strumenti utili per la ricerca sui meccanismi e il trattamento del reflusso gastroesofageo e potenzialmente dell'esofago di Barrett e dell'adenocarcinoma esofageo.
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Articolo metodologico
I modelli chirurgici di reflusso gastroesofageo con Mice
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono state segnalate diverse procedure chirurgiche in grado di indurre reflusso gastroesofageo negli animali. In questo articolo, descriviamo tre modelli chirurgici con topi volti a indurre il reflusso di contenuti gastrici, contenuti duodenali o contenuti misti. Le procedure chirurgiche e i principi generali sono stati descritti in dettaglio. Un ricercatore con esperienza chirurgica dovrebbe essere in grado di comprendere la tecnica dopo un breve periodo di pratica. Dopo l'intervento, la maggior parte dei topi può sopravvivere e sviluppare una esofagite da reflusso simile a quella umana. Tuttavia, va notato che le differenze istologiche tra l'esofago del topo e quello umano sono i limiti intrinseci di questi modelli chirurgici. Se utilizzati per la ricerca sull'esofago di Barrett e l'adenocarcinoma, queste procedure potrebbero dover essere combinate con modifiche genetiche.
Introduzione
La malattia da reflusso gastroesofageo (GERD) è una malattia cronica causata dall'esposizione prolungata dell'esofago distale a contenuti gastrici o gastroduodenali1. L'esposizione prolungata a questi reflusso nocivi compromette le difese intrinseche all'interno dell'epitelio esofageo e quindi provoca esofagite2. L'esofago di Barrett si sviluppa in presenza di reflusso cronico ed è una lesione premaligna con un aumentato rischio di adenocarcinoma esofageo3,4. Nonostante l'importanza clinica, i meccanismi della GERD, dell'esofago di Barrett e dell'adenocarcinoma non sono stati ben compresi.
I modelli animali sono essenziali per la ricerca sull'eziologia, la patologia, i meccanismi molecolari, la prevenzione e il trattamento delle malattie umane. Fino ad oggi, sono stati sviluppati vari modelli animali di GERD, esofago di Barrett e adenocarcinoma utilizzando animali modello5,6. L'esofago del topo è rivestito da epitelio squamoso stratificato che è istologicamente simile a quello dell'esofago umano. Sebbene l'esofago del topo sia diverso da quello umano in termini di cheratinizzazione e assenza di ghiandole sottomucose, il topo rimane un modello animale interessante a causa del suo costo di manutenzione relativamente basso e del suo potenziale di sofisticate modifiche genetiche. Due approcci sono comunemente utilizzati per modellare la GERD, l'esofago di Barrett e l'adenocarcinoma nei topi: la chirurgia del reflusso e le modifiche genetiche. La chirurgia del reflusso è il modo migliore per indurre il reflusso e le modifiche genetiche imitano le alterazioni molecolari5,7. La chirurgia del reflusso può essere combinata con le modifiche genetiche per comprendere ulteriormente i meccanismi della malattia8.
Molte procedure chirurgiche sono state riportate da noi e da altri6,9: (1) reflusso gastrico: legatura piloriche, costrizione piloriche con legatura dello stomaco forestomach, cardioplastica Wendel e anastomosi esofagogastreca; (2) reflusso misto: anastomosi esofagogastroduodenale, esofagoduodenostomia (o esofagoiesunostomia); (3) reflusso duodenale: anastomosi esofagogastroduodenale più gastrectomia; (4) reflusso di componenti chimiche: reflusso biliare, reflusso pancreatico, perfusione esofagea; e (5) trapianto esofageo5. Recentemente è stato riportato un modello microchirurgico del topo per produrre reflusso intestinale tramite un'esofagoiesunostomia con magneti10. Questi modelli chirurgici hanno vantaggi rispetto ai modelli di coltura cellulare in vitro o di coltura organotipic. In vitro, le cellule esofagee non possono tollerare un mezzo con alta acidità o alte concentrazioni di acidi biliari. Gli acidi biliari non coniugati che vengono comunemente utilizzati per produrre cambiamenti nelle cellule epiteliali esofagee in vitro di solito non sono presenti nel reflusso duodenale in vivo. Quindi le conclusioni tratte da tali studi in vitro devono essere prese con cautela.
La chirurgia dell'esofago del topo rimane una sfida tecnica a causa delle sue piccole dimensioni. Un basso tasso di sopravvivenza postoperatoria non consente esperimenti che richiedono una certa dimensione del campione per raggiungere conclusioni statisticamente valide. In passato abbiamo sviluppato e caratterizzato con successo modelli chirurgici di reflusso gastrico, reflusso misto, reflusso duodenale con topi in esperimenti a lungo termine9,11,12. Abbiamo anche fornito consulenza a diversi altri gruppi nella loro chirurgia sui topi. Di seguito, descriviamo tre procedure chirurgiche nei topi al fine di aiutare la comunità a stabilire questi modelli nei loro laboratori.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale.
1. Preparazione del mouse
- Utilizzare i mouse sopra ~ 20 g di peso corporeo o superiori a ~ 6 settimane di età per la chirurgia.
- Prima dell'intervento, dare topi un laboratorio chow e acqua ad libitum e mantenere su un ciclo luce-buio 00:12 h.
- Radere l'area chirurgica con un tagliatore di capelli. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di 80 mg / kg di ketamina e 12 mg / kg xilazina. Questa dose mette topi nel sonno in pochi minuti e fornisce anestesia sufficienti per le seguenti procedure chirurgiche.
- Confermare anestesia corretta basata sull'assenza di riflesso corneale e l'incolumità fisica retrazione quando la zampa viene pizzicato. Applicare lubrificante pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Sterilizzare pelle con la soluzione betadine.
2. reflusso gastrico Model (Figura 1B)
- Fare un superioreincisione mediana di ~ 2 cm a partire dal xifoide indicando l'ano.
- Aprire la cavità addominale attraverso la linea mediana. Rimuovere la xifoideo per migliorare l'esposizione con un paio di forbici.
- Separare e tagliare il tessuto connettivo tra il fegato e lo stomaco. Legare e tagliare il fascio nave tra la milza e il fondo, al fine di liberare completamente il fondo.
- Ruotare il fondo leggermente a sinistra ed esporre il lato sinistro della giunzione gastroesofageo nel campo. Effettuare una incisione longitudinale 5 mm sul muscolo lungo l'esofago distale usando un paio di forbici affilate per esporre l'epitelio.
- Tagliare aprire l'epitelio lungo la stessa direzione (incisione 1, Figura 1B). Fare tre incisioni sulla il prestomaco (incisione 2, 3 e 4, Figura 1B) per tagliare più del prestomaco con le forbici operativi taglienti. Se lo stomaco non è vuoto, rimuovere con attenzione contenuto gastrico.
- Inserire un Sutu 8-0 prolenere (con un punto conico ago) per il punto A (in esofago) e un punto '(sulla il prestomaco) con una precisione di mucosa mucosa opposizione. Allo stesso modo luogo suture per il punto B e il punto B ', e altre coppie di punti, rispettivamente. Uniformemente spazio queste suture 3-4 mm l'una dall'altra.
- Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica per pulire sangue e contenuto gastrico. Chiudere la parete addominale con suture in seta e la pelle con clip metalliche.
3. Misto reflusso Modello (Figura 1C)
- Seguire i passaggi da 2.1 a 2.4 per esporre la giunzione gastroesofagea.
- Separare delicatamente il lato dorsale dell'esofago dai vasi sanguigni dietro l'esofago. Passare una piccola punta di cotone tra i vasi sanguigni e dell'esofago.
Nota: Il cotone può essere parzialmente rimosso dalla punta per ridurne le dimensioni. Questa punta di cotone due scopi, sollevando l'esofago e proteggere i vasi sanguigni. - Fai inc due 5 millimetri longitudinaleisions ciascuno sulla giunzione gastroesofageo e l'estremità prossimale del duodeno adiacente al piloro con le forbici operativi taglienti. Per l'incisione sul duodeno, evitare i vasi sanguigni e immettere sul confine anti-mesenterica.
- Anastomose le incisioni con mucosa preciso per mucosa opposizione con interrotti 8-0 punti di sutura Prolene. Solitamente posizionare 3-4 sutura sul lato dorsale e 2-3 suture sul lato anteriore.
- Rimuovere la punta di cotone. Lavare la cavità addominale con soluzione salina normale e chiudere la parete addominale e la pelle.
4. duodenale reflusso Modello (Figura 1D)
- Seguire il passaggio da 3.1 a 3.4 per generare reflusso misto.
- Sollevare delicatamente lo stomaco per esporre il suo lato posteriore. Un lobo del fegato può essere catturato da tessuto connettivo tra il fegato e la parte posteriore dello stomaco. Asportare accuratamente i tessuti connettivi, adeguatamente proteggere il fegato, ed esporre i vasi sanguigni sul lato dorsale dell 'esofago.
- Legare etagliare i vasi sanguigni. Legare e tagliare l'esofago all'incrocio gastroesofageo.
- Legare duodeno al piloro. Legare e tagliare il mesentere. Rimuovere l'intero stomaco.
- Lavare la cavità addominale con soluzione fisiologica. Chiudere la parete addominale e la pelle.
Il trattamento post-chirurgico 5.
- Dopo l'intervento chirurgico mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. Solo dopo aver ripreso decubito sternale, posizionare il mouse posteriore con altri animali.
- Dare antibiotici e analgesici per prevenire l'infezione e alleviare il dolore. Iniettare Baytril (10 mg / kg, ip, qd, per 3 giorni) per prevenire l'infezione, e buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg, sc, offerta. Per due giorni) come antidolorifico. Il digiuno non è necessario dopo l'intervento chirurgico.
Una dieta liquida o morbido può essere dato. - Valutare lo stato di salute generale basis.If giornaliere topi mostrano i seguenti segni (drammatica perdita di peso> 15%, la mancanza di appetite, vocalizzazione, scaricare dalla bocca, il naso o gli occhi, gesto curvo, l'inattività, l'attività anormale grooming), l'eutanasia i topi.
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Risultati
La maggior parte dei topi (> 95%) possono sopravvivere chirurgia. Durante il periodo perioperatorio, le principali cause di morte includono sovradosaggio di anestetici, sanguinamento e motivi sconosciuti.
Quattro settimane dopo l'intervento,> 90% topi con reflusso gastrico o reflusso misto e> 80% topi con reflusso duodeno possono sopravvivere. Durante questo periodo, i topi muoiono principalmente da stenosi esofagea e l'incapacità di mangiare. Questi topi mostrano segni di g...
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Discussione
Vari modelli chirurgici sono stati stabiliti per imitare gastrica, duodenale e reflusso misto nei roditori. Queste tre procedure descritte sono adatte per esperimenti a lungo termine con tassi ragionevoli di sopravvivenza postoperatoria. Un ricercatore con esperienza chirurgica dovrebbe essere in grado di cogliere la tecnica, dopo un breve periodo di pratica.
Il sanguinamento può derivare da iniezione intraperitoneale di anestetici prima dell'intervento chirurgico, la lacerazione del feg...
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Dichiarazioni
Uno degli autori (XC) ha ricevuto finanziamenti forniti da Takeda Pharmaceutical Company Ltd che supporta la ricerca di base associata alla malattia da reflusso gastroesofageo. Nessuno dei reagenti o strumenti utilizzati in questo articolo è prodotto da questa azienda.
Ringraziamenti
Siamo supportati da sovvenzioni di ricerca della National Natural Science Foundation of China (NO. 81400590), National Institutes of Health (U54 CA156735) e Takeda Pharmaceutical Company Ltd. (MA-NC-D-156).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
Riferimenti
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