Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione

Sommario

Le tecniche presentate per il prelievo, l'incannulamento e la perfusione del fegato utilizzando il nostro dispositivo proprietario consentono sofisticate configurazioni di perfusione per migliorare gli esperimenti di decellularizzazione e ricellularizzazione nei fegati di ratto.

Abstract

La decellularizzazione e la ricellularizzazione degli organi parenchimali possono consentire la generazione di organi funzionali in vitro, e diversi protocolli per la decellularizzazione del fegato dei roditori sono già stati pubblicati. Abbiamo mirato a migliorare il processo di decellularizzazione mediante la costruzione di un dispositivo di perfusione proprietario che consentisse la perfusione selettiva attraverso la vena porta e/o l'arteria epatica. Inoltre, abbiamo cercato di eseguire la perfusione in condizioni di pressione circostante oscillante per migliorare l'omogeneità della decellularizzazione. L'omogeneità della decellularizzazione per perfusione è stata un fattore finora sottovalutato. Durante la decellularizzazione, le aree all'interno dell'organo che sono scarsamente perfuse possono ancora contenere cellule, mentre la matrice extracellulare (ECM) nelle aree ben perfuse può essere già interessata da detergenti alcalini. Le variazioni di pressione oscillanti possono imitare le variazioni di pressione intraaddominale che si verificano durante la respirazione per ottimizzare la microperfusione all'interno del fegato. Nello studio qui presentato, le matrici di fegato di ratto decellularizzate sono state analizzate mediante colorazione istologica, analisi del contenuto di DNA e colata di corrosione. La perfusione attraverso l'arteria epatica ha mostrato risultati più omogenei rispetto alla perfusione venosa portale. L'applicazione di condizioni di pressione oscillante ha migliorato l'efficacia della decellularizzazione della perfusione. I fegati perfusi attraverso l'arteria epatica e in condizioni di pressione oscillante hanno mostrato i migliori risultati. Le tecniche presentate per il prelievo, l'incannulamento e la perfusione del fegato utilizzando il nostro dispositivo proprietario consentono sofisticate configurazioni di perfusione per migliorare gli esperimenti di decellularizzazione e ricellularizzazione nei fegati di ratto.

Introduzione

Decellularization e Recellularization possono consentire la generazione di funzionali, organi trapiantabili in vitro ^1. By cellule rimozione e materiale antigenico (es., DNA, epitopi alfa-Gal) da un organo, la matrice extracellulare mancato o meno immunogenico (ECM) può essere ottenuto. Questa matrice conserva microanatomia tridimensionale di un organo e può servire come biomatrice ideale per ripopolamento con cellule di un differente, origine eventualmente xenogenico ^2. Così, un ratto di matrice fegato decellularized potrebbe essere ripopolata con le cellule di fegato umano. Questo umanizzato micro-fegato potrebbe servire come modello ex vivo per la ricerca sulle malattie (ad es., Le malattie metaboliche congenite, malattie virali o tumori maligni) o per test farmaceutici preclinici ^3.

Diversi protocolli diversi per fegato di ratto perfusione decellularization sono già stati pubblicati ^4-13. In tutti i protocolli, decellularzione è stato ottenuto mediante perfusione di detergenti ionici o non ionici alcaline tramite la vena porta cannulata. Per quanto a nostra conoscenza, siamo stati il primo gruppo a riferire di ratto decellularization fegato perfusione selettiva attraverso la vena porta e / o il ratto arteria epatica ^14. Attivazione della perfusione selettiva dei diversi sistemi vascolari nel fegato può consentire migliori risultati Decellularization e, inoltre, può giocare un ruolo importante nel ripopolamento cellulare.

Nello studio qui descritto, fegati sono stati perfusi in un dispositivo di perfusione di proprietà su misura, consentendo di perfusione in condizioni di pressione oscillanti. Queste condizioni di pressione imitano la perfusione respiratorie dipendente fisiologica del fegato: in situ, fegato pende sotto la copula del diaframma, il cui movimento durante la respirazione ha un impatto diretto sulla perfusione del fegato. Inspiration conduce specificamente abbassamento del diaframma e spremitura del fegato, ottimizzandoepato-deflusso venoso, che conduce alla scadenza elevazione del fegato e abbassamento della pressione intraddominale ottimizzare afflusso portale-venosa ^15.

Il nostro obiettivo era quello di valutare se le condizioni di pressione oscillanti hanno un impatto sulla omogeneità del fegato di ratto perfusione decellularization imitando condizioni intraabdominal ex vivo. L'omogeneità del processo decellularization può essere un fattore sottovalutato perfusione decellularization. Tutti gli agenti noti utilizzati per decellularization fegato causa alterazioni della ECM. Le cellule in zone poco irrorate rimangono all'interno della ECM, mentre altre zone sono già completamente decellularized. Per sciogliere le cellule rimanenti, la durata di perfusione o pressione devono essere elevate, causando più alterazioni alle aree ben irrorate-. Così, detergenti per decellularization devono essere distribuiti in modo omogeneo all'interno dell'organo.

Protocollo

Gli animali sono stati tenuti presso l'impianto di Medicina Sperimentale (FEM, Charité, Berlino, Germania), e tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dall'Ufficio di Stato per gli Affari Salute e locali (LAGeSo, Berlino, Germania; Reg. No. O 0365 / 11).

1. Fegato raccolta

1. Preparazione pre-chirurgica
   1. Utilizzare una piastra di sughero per il fissaggio. Mettere un drappo medico sul piatto. Utilizzando quattro aghi, fissare una maschera di inalazione sulla piastra di sughero per intraoperatoria inalazione narcosi.
2. Predisposizione del Portale venoso cannula
   1. Collegare un catetere venoso periferico (G 20) ad un rubinetto a tre vie. Il catetere venoso deve essere tagliato obliquamente, con una lunghezza di circa. 1,5 centimetri.
   2. De-air sistema utilizzando una siringa da 10 ml contenente una soluzione Ringer. E 'molto importante per cura de-aria, perché embolia gassosa può influenzare negativamente il decellularization perfusione.
3. Predisposizionedella cannula arteriosa
   1. Usare una cannula farfalla e tagliare l'ago ad una lunghezza di 5 mm. Montare un tubo di 5 centimetri (ID 0,58 millimetri; diametro 0,96 millimetri) per l'ago 5 mm e fissarlo con colla. Inserire una provetta 2 cm di lunghezza (ID 0,28 millimetri; diametro 0,61 millimetri) nel tubo più grande e fissarlo con colla.
   2. Infilare un altro tubo su questa costruzione da riscontro e fissarlo con colla. De-air cannula arteriosa con una siringa da 5 ml riempito con soluzione di Ringer.
4. Anestesia e Analgesia
   1. Indurre narcosi del topo nella camera di induzione di anestesia del 3,5% isoflurano in ossigeno ad un flusso di 1,5 l / min.
   2. Per garantire l'analgesia sicuro durante il funzionamento, iniettare metamizol (100 mg / kg di peso corporeo) e basse dosi di ketamina / medetomidina (10 mg / 0,1 mg per kg di massa corporea) per via intraperitoneale.
   3. Fornire 1,5% isoflurano in 1 L / min di ossigeno attraverso la maschera di inalazione per il successivo mantenimento dell'anestesia chirurgica.
5. Accordi preoperatori
   1. Radere l'addome liberamente con una macchina di taglio elettrica. Inumidire il sito di incisione rasata sull'addome con il 70% di etanolo per la disinfezione.
   2. Posto l'animale in posizione supina sul piatto preparato, inserire la testa nella maschera di inalazione e fissare le arti con nastro medico e perni. Rimuovere l'eccesso di etanolo e pelliccia con un impacco di garza.
6. Anestesia Assessment
   1. Valutare la profondità dell'anestesia guardando la frequenza respiratoria. Quando l'anestesia sembra abbastanza profondo (40-60 respiri / min), controllare che l'analgesia sia sufficiente cercando di attivare il riflesso pizzico punta con pinze chirurgiche per pizzicare la pelle tra le dita di entrambi gli arti posteriori.
7. Approccio addominale
   1. Effettuare una incisione mediana nella parete addominale caudale sopra la vescica. Tagliare da questo punto in entrambe le arcate costali laterali in modo a forma di V. Fate attenzione a non tagliare nel diaframma. Tirare la parete addominale tagliata sul petto.
   Fissare il xifoideo con un morsetto Overholt, tirarlo craniale e fissarlo con un elastico. Usare tamponi di cotone umido per evacuare l'intestino. Avvolgere l'intestino in una benda di garza umida. Inoltre, coprire tutti i margini addominale, con un bendaggio umido.
8. Fegato Preparazione
   1. Sezionare il legamento falciforme. Utilizzare una benda di garza bagnata per contenere i lobi del fegato mediali e sinistra craniale sotto la cupola del diaframma. Esporre il legamento epatoduodenale e il lobo epatico omentale superiore.
   2. Utilizzare due microforceps e forbici primavera di sezionare con cura il legamento attaccato al lobo omentale superiore fino al lobo è mobile. Spostare il lobo utilizzando tamponi di cotone bagnato sotto l'impacco di garza, tenendo i lobi mediali e lasciate in luogo.
   3. Dopo la mobilitazione del lobo epatico omentale superiore, spostare lo stomaco verso sinistra. Fissare lo stomaco con un morsetto e sezionare il omento minore con microforceps e le forbici primavera.
   4. Mobilitare la omenta bassal lobo epatico finché non è mobile e successivamente spostare il lobo indietro nella sua cavità. Utilizzare un morsetto Backhaus per mantenere il duodeno. Spostare il duodeno verso sinistra per allungare ed esporre il legamento epatoduodenale. Circoscrivere il dotto biliare comune nel legamento epatoduodenale allungato.
   5. Sezionare il dotto biliare dal adiposo e tessuto pancreatico. Tagliare il dotto biliare 1,5 cm dal biforcazione dotto biliare. Sezionare la vena porta dal tessuto adiposo circostante. Esporre la vena gastroduodenale.
   6. Legare la vena gastroduodenale due volte con la seta 6-0 e dividere la vena tra i 2 legature. Sezionare il tronco celiaco e l'arteria epatica comune dal tessuto circostante fino a quando tutti rami arteriosi si rivelano.
   7. Liberare l'arteria gastroduodenale dal tessuto circostante. Tie l'arteria gastroduodenale due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare l'arteria gastroduodenale tra i 2 legature.
   8. Liberate splenicadal tessuto circostante. Tie splenica due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare splenica tra i 2 legature.
   9. Liberare l'arteria gastrica sinistra dal tessuto circostante. Tie l'arteria gastrica sinistra due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare l'arteria tra i 2 legature.
   10. Circoscrivere la vena cava inferiore tra il rene destro e il lobo destro del fegato laterale. Sezionare la vena dallo spazio retroperitoneale. Esporre l'aorta seguendo il tronco celiaco.
   11. Sezionare il tessuto adiposo retroperitoneale. Iniettare 1.000 eparina IE in 1 ml di soluzione salina nella vena cava inferiore. Ritrarre la cannula e chiudere l'incisione con un batuffolo di cotone. Attendere 1-2 min per l'effetto sistemico dell'eparina.
   12. Circoscrivere l'aorta con una pinza. Staccare l'aorta e Exsanguinate ratto. Inoltre, sezionare la vena cava inferiore distale dal rene.
9. Portale venosa Incannulazione (Usa la cannula preparata nella sezione 1.2)
   1. Effettuare una incisione pesce-bocca nella vena porta distale. Aprire l'incisione con una pinza e incannulare la vena porta. Lavare il fegato con una soluzione di 20 ml Ringer fino agli decolorizes fegato e fissare la cannula con legature (seta 6-0).
10. Arterioso Incannulazione (Usa la cannula preparata nella sezione 1.3)
    1. Sezionare l'aorta sopra il tronco celiaco. Liberate il segmento dell'aorta dallo spazio retroperitoneale. Tagliare il segmento dell'aorta longitudinalmente per generare una patch aortica. Inserire la cannula auto-costruito in un supporto statico.
    2. Utilizzare 2 pinze a scivolare la patch aortica sopra la cannula. Legare l'arteria epatica con la seta 6-0 sopra la cannula e fissare la patch il pilastro.
11. Fegato espianto
    1. Aprire il diaframma, fare un'incisione circolare e sezionare il fegato dalle strutture circostanti.
12. Immagazzinamento
    1. Store il fegato in una sterile serbatoio 500 ml riempito con 350 ml soluzione Ringer fino al momento dell'uso.

2. detergenti Solutions

1. Soluzione al 10% Triton X-100 magazzino
   1. Riempire una bottiglia da 1.000 ml con 900 ml di acqua distillata. e aggiungere 100 ml di Triton X-100 (99,9%). Utilizzare un agitatore per sciogliere il Triton X-100. Riempire la bottiglia con acqua distillata. fino ad un volume totale di 1000 ml viene raggiunto.
2. 1% Triton X-100
   1. Aggiungere 100 ml della soluzione madre (10%) per un flacone 1000 ml. Aggiungere 900 ml di acqua distillata. e agitare la bottiglia per due volte. Filtrare la soluzione Triton X-100 1% attraverso un filtro sterile.
3. 10% SDS Stock Solution
   1. Riempire una bottiglia da 1.000 ml con 900 ml di acqua distillata. e aggiungere 66.99 g SDS (99,9%, di densità 0,67). Utilizzare un agitatore per sciogliere la SDS. Riempire la bottiglia con acqua distillata. fino ad un volume totale di 1000 ml viene raggiunto.
4. 1% SDS
   1. Aggiungere 100 ml di soluzione di riserva (10%) per un bot 1.000 mlTLE. Aggiungere 900 ml di acqua distillata. e agitare la bottiglia per due volte. Filtrare la soluzione SDS 1% attraverso un filtro sterile.

3. Decellularization

1. Set-up del dispositivo di perfusione

Figura 1:. Schema del dispositivo di perfusione selettiva per arterioso e venoso portale Perfusione di Quattro Rat Livers sotto oscillanti Condizioni Pressione (. Modificato da Struecker et al ¹⁴⁾

1. Collegare lo scarico di un rubinetto a tre vie e un'estensione Heidelberger per regolare il livello di riempimento e riempire il reattore da 500 ml 0,9% NaCl.
   

Figura 2:. Schema della perfusione set-up Collegare la camera di perfusione (1.400 cm ³⁾ (1) all'estremità distale (4) del gorgogliatore (5) tramite l'accesso venoso portale (2) o tramite ac arteriosaprocesso (3). Il gorgogliatore (5) deve essere dotato di un otturazione (4) in corrispondenza dell'estremità distale e uno sfiato (6). Collegare il gorgogliatore (5) ad un'estensione Heidelberger (7). Collegare l'estensione Heidelberger al segmento della pompa (8). Inoltre, collegare il segmento della pompa (8) a un altro interno Heidelberger (9). Inserire l'ultima estensione Heidelberger (9) nella bottiglia di soluzione detergente (10). Collegare il respiratore (11) alla camera di perfusione (o al distributore pressione in caso di più perfusioni). Per drenare i fluidi reattore, collegare il deflusso alla bottiglia rifiuti (12).

1. Inserire il segmento pompa nella pompa. Avviare la pompa per riempire il ciclo con PBS, chiudere l'estremità distale del gorgogliatore e aprire la bocchetta. Quando il fondo della bolla è coperto saldamente con PBS (2-3 cm), chiudere lo sfiato e aprire l'estremità distale del gorgogliatore.
2. Fegato di installazione
   1. Collegare il rubinetto a tre vie della cannula vena porta al relativo accesso reattore. Collegare la cannula arteriosa all'accesso arteriosa. Fare attenzione al fine di garantire che l'aria non entra nei sistemi.
3. Applicazione di oscillanti Condizioni Pressione
   1. Utilizzare un respiratore con una frequenza di 15 bpm e un'ampiezza di 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Collegare il respiratore alla camera di distribuzione della pressione e collegare la camera al reattore. Avviare l'applicazione di pressione.
4. Decellularization Protocol
   1. Eseguire passaggi perfusione con un flusso di 5 ml / min. Avviare il decellularization con perfusione del fegato con 1% Triton X-100 per 90 min. Consentire effluence rifiuti tramite il deflusso del dispositivo perfusione per mantenere il livello del fluido all'interno della camera di perfusione e costante del fegato perfuso. Dopo 90 min, cambiare il detergente 1% SDS.
      
      

Figura 3: perfusione Protocollo per tutti i gruppi sperimentali.

Risultati

L'omogeneità e quindi l'efficacia dei protocolli Decellularization differenti sono stati valutati mediante l'osservazione macroscopica, analisi istologica, e l'analisi del contenuto di DNA rimanendo entro matrici fegato decellularized. Inoltre, la corrosione colata è stata effettuata per visualizzare il microanatomia intatto di fegati dopo decellularization.

Macroscopia

Durante decellularization, fegati diventano Lucent, che indica la rimozione del contenuto cell...

Discussione

Anche se la tecnica presentata per la raccolta del fegato di ratto e decellularization è facilmente riproducibile, ci sono alcuni passaggi critici da considerare:

Durante la preparazione per la raccolta del fegato, è importante evitare emorragia grave perché attiverà la coagulazione del sangue e può portare alla formazione di coaguli di sangue all'interno del fegato. A nostro avviso, è vantaggioso incidere aorta addominale direttamente prima incannulazione della vena porta per evitare af...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cannula arteriosa autocostruita
Tubo in polietilene non sterile Portex	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm ID 0,61 mm OD
Tubo in polietilene non sterile Portex	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm OD
Venodrop Catetere a farfalla sicuro	Fresenius Kabi	3275851	21 G
porta
Catetere venoso periferico	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Rubinetto a tre vie	smiths medical	888-101RE
Bastoncini di cotone	Hecht-Assistent	4302
dischetti di cotone	Shaoxing Zhengde Medicazione chirurgica	13H118-03
Garza Bendaggio	Hubei Haige  Strumenti medici	14388
Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Siringa	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Siringa	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Suture (Seta 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
telo medico	Shaoxing Zhengde Medicazione chirurgica	D0613011
chirurgico porta aghi per strumenti
	Geuder	17570
micro-pinza	Inox-Electronic	91150-20
micro-forbici	Martin	11-740-11
micro-pinza	S& T
Morsetto	Aesculap	BH111R
forbici	F S T	14501-14
pinza chirurgica	Aesculap	BD 557<
	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Dispositivo di perfusione	Charite, laboratorio di ingegneria medica	dispositivo su misura	la decellularizzazione
pompa peristaltica ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 canali
Prolunga Heidelberger 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA segmento pompa	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
Tubo CA 2-tappo	Trappola a	BPT NSF-51
		articolo
Connettore per tubo flessibile Luer Lock	Neolab	n. 02-1887
Detergenti
Pellet SDS	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
colorazione
Eosina 1%	Morphisto	10177
Mayer ematossilina	AppliChem	A4840
colorazione gomori	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS colorazione	Morphisto	11388
Rosso diretto 80	Sigma Aldrich	365548