L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo. Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.
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Articolo metodologico
Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'occhio è un organo piccolo e chiuso, il che lo rende un bersaglio ideale per la terapia genica. Recentemente sono state applicate varie strategie alla terapia genica nelle retinopatie utilizzando il rilascio genico non virale e virale alla retina e all'epitelio pigmentato retinico (RPE). L'iniezione sottoretinica è l'approccio migliore per fornire vettori virali direttamente alle cellule RPE. Prima della sperimentazione clinica di una terapia genica, è inevitabile validare l'efficacia della terapia in modelli animali di varie retinopatie. Pertanto, l'iniezione sottoretinica nei topi diventa una tecnica fondamentale per una terapia genica oculare. In questo protocollo, forniamo la tecnica semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali a topi sperimentali. Questa tecnica è modificata dall'iniezione intravitreale, che è una tecnica ampiamente utilizzata nelle cliniche oftalmologiche. I risultati rappresentativi del complesso RPE/coroide/sclerale a montaggio piatto aiuteranno a comprendere l'efficacia di questa tecnica e a regolare il volume e il titolo dei vettori virali per l'entità della trasduzione genica.
Introduzione
In oftalmologia, la terapia genica è emerso come la modalità di trattamento di retinopatie ereditarie monogeniche. Ci sono retinopatie ereditarie associate a geni in epitelio pigmentato retinico (RPE) compresi Leber amurosis congenita 1,2, retinite pigmentosa 3, e Coroideremia 4. Il campo di ricerca della terapia genica si sta espandendo in entrambi gli studi preclinici e sperimentazioni cliniche utilizzando vettori virali come il virus adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) e adenovirus (Ad) 5. Vettori virali differenti hanno tropismo differente nella retina. Per una terapia genica efficace e s....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali dell'Università Istituzionale e Usa Comitato Nazionale di Seul e Seoul National University Hospital Comitato Biosicurezza.
1. Preparazione Kit iniezione e vettori virali
- Preparare la siringa microlitro dotata di un ago smussato 33 G sterilizzato con ossido di etilene. Diluire i vettori virali in PBS per il titolo adeguata nel tubicino (cioè, 1 x 1....
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Risultati
Per valutare l'efficacia dell'iniezione sottoretinica sulla trasduzione genica virale da questo protocollo, abbiamo utilizzato in commercio vettori LV con CMV promoter esprime sia GFP e RFP per l'indicatore. Gli occhi sono stati enucleato dopo il periodo di tempo appropriato in base allo scopo di ricerca. Per i risultati rappresentativi, gli occhi sono stati enucleati 10 settimane e 20 settimane dopo l'iniezione sottoretinica. Dopo la rimozione completa della retina con il metodo sopra descritto, l'a.......
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Discussione
In questo articolo il video, abbiamo descritto il limbare approccio tecnica di iniezione sottoretinica in dettaglio con risultati rappresentativi di RPE / coroide / sclerale flat-mount. Questa è una tecnica facile e conveniente per l'iniezione sottoretinica di vettori virali in RPE. La visualizzazione diretta della formazione di bozza durante l'iniezione è un passo importante per la consegna accurata per i principianti. Ci sono alcune tecniche di iniezione subretiniche introdotte nel Journal of Experiments Visua.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Seoul National University Research di Grant (800-20140542), il Programma Pioneer Research di NRF / MEST (2012-0009544), e la Bio-Signal Analysis Tecnologia Programma Innovazione NRF / MEST (2009-0090895), e la concessione di NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PINZE DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm PUNTE | WPI | 500233 | |
| VANNAS Forbici S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Ago smussato | WPI | NF33BL-2 | |
| Siringa NanoFil, 10 microlitri | KIT WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | Per una facile iniezione con una sola mano |
| 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Ago | BD | 305107 | Puntura iniziale per iniezione sottoretinica |
| Occhiali di copertura per microscopio (n. 1 diametro 3 mm) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Microscopio operatorio Leica | Leica LM M80 | ||
| Microscopio a fluoreseceina | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO. LV-CTR | Utilizzato per diluire i vettori |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Utilizzato per diluire i vettori |
| Troperina (Fenilefrina 0,5% - Tropicamide 0,5%) | Hanmi | Per dilatazione | |
| Proparacaina cloridrato Soluzione oftalmica USP, 0,5% (sterile) | Bausch& Lomb | Per anestesia topica | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (ipocloruro di tiletamina e ipocloruro di zolazepam) | Virbac | Per anestesia generale | |
| Iniezione di Rompun (xilazina HCl) | Bayer | Per anestesia generale |
Riferimenti
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber c....
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Ristampe e permessi
